劉志武武會(huì)芝王 霞李健和

（1 岳陽市一人民醫(yī)院，湖南 岳陽 410004；2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長(zhǎng)沙 410011；3 中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

注射用埃索美拉唑鈉無菌及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)的研究

劉志武1武會(huì)芝2,3王 霞2,3李健和2

（1 岳陽市一人民醫(yī)院，湖南 岳陽 410004；2 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 長(zhǎng)沙 410011；3 中南大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

目的建立注射用埃索美拉唑鈉無菌和細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查法。方法采用中國(guó)藥典2010年版二部附錄無菌和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。結(jié)果樣品管無菌生長(zhǎng)，6株陽性對(duì)照菌生長(zhǎng)良好。注射用埃索美拉唑鈉稀釋至濃度為1.0 mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法無干擾作用。結(jié)論采用薄膜過濾法進(jìn)行注射用埃索美拉唑鈉的無菌檢查，使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查注射用埃索美拉唑鈉中的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的。

注射用埃索美拉唑鈉；無菌；薄膜過濾法；細(xì)菌內(nèi)毒素；鱟試劑

注射用埃索美拉唑鈉是一種質(zhì)子泵抑制劑，通過抑制胃壁細(xì)胞的H+-K+-ATP酶來降低胃酸分泌，防止胃酸的形成，用于患胃食管反流疾病而無法吞食埃索美拉唑緩釋膠囊患者的短期治療[1]。鑒于近年來該制劑銷售勢(shì)態(tài)良好，其臨床應(yīng)用療效肯定，無明顯毒副作用，故立項(xiàng)研究開發(fā)規(guī)格為40 mg的注射用埃索美拉唑鈉。目前尚未見注射用埃索美拉唑鈉無菌及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法研究的報(bào)道，本品屬注射類制劑，為了確保臨床用藥安全，故參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]，并按照中國(guó)藥典2010年版二部無菌和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求[6-7]，對(duì)本品進(jìn)行了無菌和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)的研究。現(xiàn)將其研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 試驗(yàn)材料

儀器：HTY-2000型智能集菌儀及一次性全封閉集菌器（杭州泰林醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）；SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)（蘇州凈化有限公司）；FA2004A電子分析天平（上海精天電子儀器有限公司）；PYX-DHS細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；MJ-160B霉菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠）；201-1-S型電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；XW-8/0A渦輪混合器（上海琪特分析儀器有限公司），ET-96內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司），規(guī)格為250 μL和1000 μL的微量移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

菌種與培養(yǎng)基：銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；生孢梭菌 [CMCC（B）64941]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)：121022）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：130516）；改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：120113）；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)：120409）；改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：120410）。以上菌種和培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，菌種代數(shù)均為第3代。

鱟試劑（TAL）：湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：0.1 mL，批號(hào)：1310230，靈敏度：0.25 Eu/mL；湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：0.1 mL，批號(hào)：1310301，靈敏度：0.125 Eu/mL；湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格：0.1 mL，批號(hào)：1306070，靈敏度：0.25 Eu/mL；湛江博康海洋生物有限公司，規(guī)格：0.1 mL，批號(hào)：1306060，靈敏度：0.125 Eu/mL。

細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院，規(guī)格：1 mL，批號(hào)：150601-201377，效價(jià)：70 Eu/支。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)用水（BET）：中國(guó)食品藥品檢定研究院，規(guī)格：5 mL，批號(hào)：2011-8。

供試品：注射用埃索美拉唑鈉由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部研制生產(chǎn)，批號(hào)：20130901、20130902、20130903，規(guī)格：40 mg。

2 無菌檢查方法學(xué)

2.1 菌液制備：接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，于30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23～28 ℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)＜100CFU的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，于23～28 ℃培養(yǎng)5～7 d，加入5 mL含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含孢子數(shù)＜100 CFU的孢子懸液。

2.2 方法驗(yàn)證：按中國(guó)藥典2010年版二部附錄Ⅺ H，采用薄膜過濾法進(jìn)行驗(yàn)證。取供試品20支，加0.9%氯化鈉溶液適量使溶解；采用一次性二聯(lián)濾器，先將濾器用少量稀釋劑潤(rùn)濕，使稀釋劑順利流出，再將供試品溶液注入濾器，濾干，每筒用100 mL、200 mL 0.1%無菌蛋白胨水溶液（含＜100 CFU試驗(yàn)菌）沖洗，濾干，將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基100 mL注入二聯(lián)濾器。置規(guī)定溫度培養(yǎng)5 d逐日觀察結(jié)果。

2.3 試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1中的結(jié)果表明：按規(guī)定量取供試品照薄膜過濾法處理，當(dāng)每膜用0.1%蛋白胨水溶液沖洗達(dá)100 mL時(shí)，可消除本品對(duì)試驗(yàn)所用細(xì)菌、霉菌和酵母菌生長(zhǎng)的影響。

表1 無菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

2.4 結(jié)論：經(jīng)上述方法驗(yàn)證試驗(yàn)，確定本品無菌檢查方法如下：取本品，加0.9%氯化鈉溶液適量使溶解，經(jīng)薄膜過濾法處理，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗（每膜100 mL），以金黃色葡萄球菌為陽性對(duì)照菌，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

3 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)

3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）的確定：根據(jù)公式：L=K/M，其中K為按規(guī)定的給藥途經(jīng)，人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，靜脈注射K=5 EU/（kg·h），M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)接受注射用埃索美拉唑鈉的最大劑量。參考本品臨床的用法用量可知，推薦每日1次靜脈注射或靜脈滴注本品20～40 mg。反流性食管炎患者應(yīng)使用40 mg，每天1次；對(duì)于反流疾病的癥狀治療應(yīng)使用20 mg，每天1次。注射用藥：配制溶液的靜脈注射時(shí)間應(yīng)至少在3 min以上；滴注用藥：配制溶液的靜脈滴注時(shí)間應(yīng)在30 min內(nèi)。滴注液的制備是通過將本品1支溶解至0.9%氯化鈉溶液100 mL，供靜脈滴注使用。M=40 mg/（60 kg·1 h）≈0.67mg/（kg·h），K= K1+K2，其中K1為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受本品的內(nèi)毒素劑量，K2為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受0.9%氯化鈉溶液100 mL的內(nèi)毒素劑量，K2＝100×0.5/（60 kg·1 h）≈0.83 EU/（kg·h），因此，K1＝（K-K2）=5-0.83=4.17 EU/（kg·h）。L＝K1/M＝4.17/0.67≈6.2 EU/mg。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20080211中規(guī)定注射用埃索美拉唑鈉的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查為：每1 mg埃索美拉唑鈉中含內(nèi)毒素量應(yīng)不得過2.0 EU，嚴(yán)于理論限值，為了便于操作和從嚴(yán)控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保臨床用藥安全，本品細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）定為2.0 EU/mg。

3.2 有效稀釋濃度（MVC）的計(jì)算：根據(jù)公式MVC=λ/L，其中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度。目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03 EU/mL之間，則本品的對(duì)應(yīng)有效稀釋濃度為：C0.5=0.5/2.0=0.25 mg/mL；C0.03=0.03/2.0=0.015 mg/mL。

3.3 鱟試劑靈敏度的復(fù)核：按中國(guó)藥典2010年版二部附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”規(guī)定的方法進(jìn)行TAL靈敏度復(fù)核，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用BET溶解，在渦輪混合器上混合15 min后分別制成不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在渦輪混合器上混合30S。取復(fù)溶后的每支0.1mL不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)內(nèi)毒素濃度平行4管，另取2管加入0.1mLBET作為陰性對(duì)照。2批不同靈敏度的TAL分別進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 TAL靈敏度復(fù)核試驗(yàn)結(jié)果

表1結(jié)果表明：上述2批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)核靈敏度，λc在2.0～0.5λ之間，均可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

3.4 干擾實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)：將本品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別稀釋成濃度為1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03、0.015 mg/mL的埃索美拉唑鈉溶液，將此系列濃度溶液記為NPC。同時(shí)按上述試驗(yàn)液濃度配制并加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每一濃度的試驗(yàn)液中均含有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，記此系列濃度為PPC。取靈敏度分別為0.125、0.25 EU/ mL的兩個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述PPC和NPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管，并設(shè)陽性和陰性對(duì)照。

由以上預(yù)干擾試驗(yàn)結(jié)果可以初步了解：對(duì)兩個(gè)廠家鱟試劑，本品三批樣品細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)結(jié)果均在濃度為1.0 mg/mL以下時(shí)無干擾。

3.5 干擾實(shí)驗(yàn)：為了最終確認(rèn)是否存在干擾因素的影響，進(jìn)行以下正式干擾試驗(yàn)。取本品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水分別進(jìn)行稀釋，使其最終干擾試驗(yàn)濃度為1.0 mg/mL，按中國(guó)藥典2010年二部附錄中的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾項(xiàng)”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

正式干擾試驗(yàn)結(jié)果表明：Es在2.0～0.5λ之間（包括2.0λ和0.5λ）及Et在2.0～0.5Es之間時(shí)，確認(rèn)本品在1.0 mg/mL濃度下無干擾影響。

3.6 樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查：按中國(guó)藥典2010年版二部附錄中的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，使用兩批不同廠家的鱟試劑分別對(duì)三批注射用埃索美拉唑鈉進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并同時(shí)設(shè)立樣品的自身陽性對(duì)照管。

3.7 結(jié)論：經(jīng)上述方法驗(yàn)證試驗(yàn)，確定本品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法如下：依法檢查（中國(guó)藥典2010年版二部附錄Ⅺ E），每毫克埃索美拉唑鈉中細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)＜2.0 EU。

4 討 論

4.1 無菌檢查法所用沖洗液為0.9%滅菌氯化鈉溶液，該液主要有調(diào)節(jié)等滲作用，而無菌檢查中還需考慮在大量沖洗后細(xì)菌易受損及營(yíng)養(yǎng)支持問題，因此選用含營(yíng)養(yǎng)成分的0.1%蛋白胨水溶液即可滿足要求。此外，拉唑類藥物在蛋白胨溶液中易形成混懸液影響過濾，故本品應(yīng)先用0.9%無菌氯化鈉溶液溶解后過濾，再用0.1%蛋白胨水溶液沖洗。本品需用100 mL0.1%蛋白胨水溶液沖洗后才能消除抑菌成分，應(yīng)少量多次沖洗，每張濾膜每次沖洗量不能過多，總沖洗量不宜過大，以避免濾膜上的微生物受損傷。

4.2 無菌檢查目的，既要保證中國(guó)藥典2010年版二部規(guī)定的所有陽性對(duì)照菌正常生長(zhǎng)，又要準(zhǔn)確無誤檢查樣品染菌情況。經(jīng)實(shí)驗(yàn)建立的方法驗(yàn)證試驗(yàn)其既能保證6株陽性對(duì)照菌正常生長(zhǎng)，又能準(zhǔn)確無誤檢查本品染菌情況故可作為注射用埃索美拉唑鈉的無菌檢查法。

4.3 樣品預(yù)干擾試驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)樣品濃度對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)的干擾程度及干擾性質(zhì)，以便初步篩選出對(duì)檢查無干擾的樣品濃度范圍。試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品濃度在0.015～1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法均無干擾作用。采用1.0 mg/mL供試品溶液進(jìn)行干擾確證試驗(yàn)，Es在2.0～0.5λ之間（包括2.0λ和0.5λ）及Et在2.0～0.5 Es之間（包括2.0 Es和0.5 Es），說明1.0 mg/mL供試品溶液不干擾鱟試驗(yàn)。采用兩個(gè)廠家的鱉試劑與供試品溶液（1.0 mg/mL）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限量均在2.0 EU/mg限值以下，供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限量均合格，故本品采用限值2.0 EU/mg進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是可行的。

[1] 于志卿,王美玲,王洪欣.注射用埃索美拉唑鈉[J].齊魯藥事,2005,24(12):758.

[2] 方玲芬,徐洪.注射用奧美拉唑鈉無菌檢查法方法學(xué)研究[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2006,7(4):64-66.

[3] 朱梅紅,吉同琴.注射用蘭索拉唑無菌檢查方法學(xué)研究[J].西北藥學(xué)雜志 2008,23(6):381-383.

[4] 潘正興,宋勤.注射用奧美拉唑鈉細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[J].藥物分析雜志,2008,28(2):275-277.

[5] 戴艷,吉同琴.注射用蘭索拉唑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[J].中國(guó)藥師,2009,12(1):122-123.

[6] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].2010年版.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].2010年版.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄88-91.

Studies on Bacterial Endotoxin Test and Sterility Test for Esomeprazole Sodium for Injection

LIU Zhi-wu1, WU Hui-zhi2,3, WANG Xia2,3, LI Jian-he2
(1 The First People's Hospital of Yueyang, Yueyang 414000, China;2 Department of Pharmacy The Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China;3 Pharmacy of Central South University,Changsha 410013, China)

ObjectiveTo establish bacterial endotoxin test and sterility test for esomeprazole sodium for injection.MethodsAccording to the method of determination of bacterial endotoxin and sterility approved by Chinese Pharmacopoeia 2010 edition.ResultsAll of six strains positive control tubes reveal growth of micro-organism and the substance control gives no evidence of growth.The interference on the determination of bacterial endotoxin can be excluded when esomeprazole sodium for injection was diluted 1.0mg/mL.ConclusionIt is feasible to detect the bacterial endotoxin and microbial contamination of esomeprazole sodium for injection by the method of determination of bacterial endotoxin and membrane filtration,respectively.

Esomeprazole sodium for injection; Sterility test; Membrane filtration method; Bacterial endotoxin test; Tachypleus amebocyte lysate

R975

B

1671-8194（2014）22-0010-03