高林江劉幸平韓莎莎姜紅巖李金玉黃展勤*

（1 汕頭市中心血站，廣東 汕頭 515064；2 汕頭大學醫(yī)學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041）

離體和在體機械損傷致血管平滑肌增殖模型的建立

高林江1劉幸平2韓莎莎2姜紅巖2李金玉2黃展勤2*

（1 汕頭市中心血站，廣東 汕頭 515064；2 汕頭大學醫(yī)學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041）

目的建立離體和在體機械損傷致血管平滑肌增殖模型。方法原代培養(yǎng)大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞（VSMCs），體外建立機械劃傷致VSMCs增殖模型，采用5-溴脫氧尿嘧啶（5-BrUd）摻入法，流式細胞術(shù)檢測細胞增殖情況；整體動物上，采用新西蘭兔左側(cè)頸總動脈球囊損傷，術(shù)后7d 取頸總動脈段，常規(guī)病理切片，HE染色，觀測血管內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積、內(nèi)膜厚度/中膜厚度、內(nèi)膜面積/中膜面積。結(jié)果機械劃痕損傷12 h后劃傷處兩側(cè)的細胞開始有部分增殖和遷移，24 h后細胞增殖較為明顯。流式細胞術(shù)檢測機械損傷后細胞增殖增多（P＜0.05）。整體動物上，與假手術(shù)組比較，模型組術(shù)后7 d血管內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜面積、內(nèi)膜厚度/中膜厚度、內(nèi)膜面積/中膜面積顯著增加（P＜0.01）。結(jié)論機械損傷可以導致離體和在體血管平滑肌細胞增殖。

機械損傷；血管平滑肌細胞；增殖；離體；在體

盡管經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)是治療缺血性心臟病的重要手段，但由于機械損傷導致血管平滑肌細胞（VSMCs）的增殖和遷移，從而引起血管重塑和再狹窄（RS）往往影響了療效[1]。本課題組一直致力于心血管藥理的研究和心血管活性藥物的研發(fā)，探討血管平滑肌增殖的機制及其信號通路的調(diào)節(jié)，及RS的藥物干預是本課題組的興趣所在[2,3]。為深入研究機械損傷致血管平滑肌增殖的機制以及進行藥物的干預，建立機械損傷致血管平滑肌增殖的離體和在體模型是基礎(chǔ)，本實驗室經(jīng)過反復實驗，成功建立了離體大鼠胸主動脈VSMCs機械損傷后增殖的模型以及模擬PTCA術(shù)后VSMCs增殖和RS的病理過程，建立了家兔球囊剝脫內(nèi)皮致家兔頸動脈狹窄整體動物模型，為研究VSMCs增殖的機制和防治提供了較好的實驗平臺。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SD大鼠（汕頭大學醫(yī)學院動物中心提供），體質(zhì)量180 g左右，清潔級新西蘭兔，體質(zhì)量2.5 kg（汕頭大學醫(yī)學院動物中心提供），方案經(jīng)我院實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 藥品與試劑

細胞增殖以及細胞DNA含量檢測試劑盒（凱基生物科技公司）；TRIzol試劑（Invitrogen）；SABC免疫組化染色試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；5-BrUd為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）；FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）

1.4 大鼠胸主動脈VSMCs培養(yǎng)及鑒定

①原代培養(yǎng)：Sprague-Dawley大鼠經(jīng)處死，分離胸部主動脈刮除內(nèi)膜，經(jīng)Hank’s液洗凈，在含1%胎牛血清的培養(yǎng)液中剪碎，貼壁，在37 ℃、95% O2+5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h。5 d后換液繼續(xù)培養(yǎng)。②傳代培養(yǎng)：鏡下觀察到VSMCs長至融合后，以0.025%胰蛋白酶+0.20%EDTA消化液消化細胞，經(jīng)離心，傳代，在1%FBS+DMEM培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后換液。③細胞鑒定：倒置顯微鏡下，VSMC呈典型的“谷-峰”樣生長，經(jīng)VSMCs特異性抗體抗α-SM actin抗體免疫組化染色顯示VSMC胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒，陽性細胞達95%以上。實驗用第3～4代細胞。

1.5 離體機械損傷VSMCs的制備與培養(yǎng)

報道的方法[4]，制備模擬PTCA球囊擴張或支架造成血管平滑肌的機械性損傷的離體細胞模型，用消毒后的玻璃棒鈍端沿著擦刮平鋪在培養(yǎng)皿上的平滑肌細胞，造成機械損傷，觀察再生和遷移的情況時，在損傷的基礎(chǔ)上，沿直線劃分細胞刮除區(qū)，刮除細胞，造模成功后，繼續(xù)培養(yǎng)，方法同上。

1.6 5-溴脫氧尿嘧啶（5-BrUd）摻入法檢測細胞增殖情況

VSMCs細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，90%貼壁（6 cm培養(yǎng)皿）后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12～18 h，加入相應(yīng)的試劑，然后用100 mL槍頭在皿中劃線，每皿劃線方向和數(shù)量一致，造成機械劃傷模型。加入10 μLBrdu（1 mmoL/L），在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h。經(jīng)收集、處理細胞后流式細胞儀檢測BrdU和7-AAD共染陽性率。

1.7 新西蘭兔頸總動脈內(nèi)膜球囊損傷模型的建立

參照文獻介紹方法，建立新西蘭兔頸總動脈內(nèi)膜球囊損傷模型[5]。新西蘭兔經(jīng)麻醉，消毒，分離左側(cè)頸總動脈以及頸內(nèi)動脈和頸外動脈。在頸外動脈結(jié)扎處近端做一“V”形切口，向近心端插入2.0F球囊導管到頸總動脈，然后通過壓力泵加壓球囊，回拉充分膨脹的球囊至頸內(nèi)、頸外動脈分叉處，停30 s后再回送球囊，造成球囊摩擦損傷頸總動脈，并此動作重復3次。實驗結(jié)束后，縫合傷口，每天肌注80萬U青霉素，連續(xù)3 d，避免傷口感染。

1.8 病理標本及形態(tài)學的觀察

球囊損傷后7 d后處死新西蘭兔，充分清洗頸總動脈后，10%中性福爾馬林固定頸總動脈24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備血管切片，進行HE染色。血管橫切面圖像用計算機圖像分析系統(tǒng)，測定血管新生內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積、中膜厚度、中膜面積、并計算新生內(nèi)膜面積/中膜面積。

2 結(jié) 果

2.1 機械損傷致VSMCs增殖大體觀察

采用劃線法，體外建立VSMCs機械損傷模型，促使VSMCs增殖，圖1顯示了不同時間點下劃傷處VSMCs損傷的情況，可觀察到損傷12 h后劃傷處兩側(cè)的細胞開始有部分增殖和遷移，24 h后細胞增殖較為明顯。

2.2 機械損傷對VSMCs增殖的影響

流式細胞儀檢測正常培養(yǎng)組（Control組）和機械損傷組（model組）BrdU和7-AAD共染陽性率，如圖2所示。7-AAD是染色晚期凋亡及死亡細胞，顯示在右下區(qū)；左上區(qū)是單染Brdu細胞。左下區(qū)顯示的是雙陰性細胞。右上區(qū)是BrdU和7-AAD共同染色區(qū)域，即增殖細胞。圖2B機械損傷組的細胞右上區(qū)域比圖2A正常培養(yǎng)組右上區(qū)細胞量增多，說明細胞明顯增殖。

2.3 血管形態(tài)學觀測結(jié)果

圖3A顯示假手術(shù)組兔頸總動脈內(nèi)膜僅由一層內(nèi)皮細胞構(gòu)成，內(nèi)、外彈力膜結(jié)構(gòu)整齊，中膜層VSMCs成梭形排列。圖3 B顯示機械損傷組血管在術(shù)后7 d有新生內(nèi)膜，并增厚，中膜平滑肌增殖，向內(nèi)膜遷移，VSMCs核體積明顯增大，胞質(zhì)增多。

3 討 論

VSMCs異常增生是動脈粥樣硬化斑塊形成和血管損傷后發(fā)生的血管再狹窄等多種疾病的共同病理特征。深入研究VSMCs增殖的因素及機制對心血管疾病的防治有著重要的意義。然而，一個好的VSMCs增殖模型是研究VSM增殖的重要前提。

本實驗直接采用正常血管貼壁培養(yǎng)傳代細胞，并用劃痕方法造成血管平滑肌的機械損傷。我們觀察了這種機械損傷對血管平滑肌的時效關(guān)系，大體可觀察到損傷12 h后損傷處的細胞開始增殖和遷移，24 h后細胞增殖較為明顯，說明機械損傷可導致血管平滑肌的增殖。

溴脫氧尿嘧啶核苷是DNA前體胸腺嘧啶核苷類似物，通過競爭摻入S期細胞單鏈DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU與胸腺嘧啶競爭摻入的強度可能與細胞增殖有關(guān)，如肝癌細胞約11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝細胞僅有1.1%[6]。近年來非放射性標志物的研究發(fā)展迅速，然而其敏感性多數(shù)不及同位素，使實驗受限。自1982年Gratzer制備出抗BrdU單抗及標記檢測技術(shù)不斷改良提高，用BrdU標記的敏感性已與氘胸腺嘧啶核苷相似。目前認為BrdU是最有希望取代同位素的非放射性標志物之一。本實驗在形態(tài)學觀察的基礎(chǔ)上，通過應(yīng)用流式細胞儀檢測正常培養(yǎng)組（Control組）和機械損傷組（model組）BrdU和7-AAD共染陽性率，實驗結(jié)果證實機械損傷后血管平滑肌細胞明顯增殖。

圖1 血管平滑肌細胞體外機械損傷模型

圖2 5-BrUd摻入法檢測機械損傷細胞增殖的影響

圖3 兔頸總動脈HE染色

Rs的發(fā)生過程復雜，目前認為血管內(nèi)皮損傷，從而導致血管平滑肌增殖，并向內(nèi)膜遷移，增厚是引起經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后再狹窄的主要機制[7]。新西蘭兔的血管接近人類血管生物學原理，易于復制血管損傷模型。因此本實驗模擬人類經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)，采用動脈球囊，造成血管機械損傷，并通過形態(tài)學觀察RS形成過程中血管內(nèi)膜和中膜的動態(tài)變化。本實驗的HE染色結(jié)果顯示，血管在球囊損傷后7 d，可見有新生內(nèi)膜，內(nèi)膜增厚，大量的平滑肌細胞增殖并遷移至內(nèi)膜，此結(jié)果與文獻報道一致[8]。

綜上所述，本實驗從離體培養(yǎng)的血管平滑肌細胞整體動物頸總動脈均成功建立了機械損傷血管平滑肌增殖模型，為進一步研究機械損傷致血管平滑肌增殖的機制及探討藥物防治血管再狹窄打了堅實的實驗平臺。

參考文獻

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[3] 黃展勤,李金玉.碘化N-正丁基氟哌啶醇對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞肥大的抑制作用[J].中國藥理學通報,2013,29(7):913-917.

[4] Liang KW,Ting CT.Berberine suppresses MEK/ERK-dependent Egr-1 signaling pathway and inhibits vascular smooth muscle [J]. Biochem Pharmacol,2006,71(6):806-817.

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[7] Ciro Indolf i,Daniele Torella.Rat carotid artery dilation by PTCA balloon catheterinduces neointima formation[J].Am J Physiol Heart Circ,2002,283(2):H760-767.

[8] Wang L,Zheng JG.ADAMTS-7 Mediates Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation[J].Circ Res,2009,104(5):688-698.

Establishment of the Proliferation Model of Vascular Smooth Muscle Cells Induced by Mechanical Injury in Vitro and in Vivo

GAO Lin-jiang1, LIU Xing-ping2, HAN Sha-sha2, JIANG Hong-yan2, LI Jin-yu2, HUANG Zhan-qin2*
(1 Shantou Blood Center, Shantou 515064, China; 2 Department of Pharmacology, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

ObjectiveTo establish the proliferation model of vascular smooth muscle cells induced by mechanical injury in vitro and in vivo.MethodsThe primarily cultured rat thoracic aortic SMCs were used to establish mechanical injury models in vitro. The proliferation activity of VSMCs was analyzed by flow cytometry with 5-BrUd incorporation. The proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in vivo was established by balloon injury on the rabbit carotid artery. After 7 days, experimental segments of arteries were harvested and subsequently progressed routine pathological sections, hematoxylineosin staining.ResultsThe proliferation and migration of VSMCs were observed after 12h mechanical injury, especially after 24h. Compared with the sham group, the proliferative cells were increased by mechanical injury by the analysis of flow cytometry(P＜0.05). Tthe intimal thickness, intimal area, intimal/medial thickness and intima-to-media area ratio of the Model group significantly increase comparing to the sham group (P＜0.01).ConclusionThe proliferation model of vascular smooth muscle cells induced by mechanical injury in vitro and in vivo were successfully established.

Mechanical damage; Vascular smooth muscle cells; Proliferation; Vitro; In vivo

R654.2

B

1671-8194（2014）22-0001-02

國家自然科學基金資助項目（No.30901810），廣東省自然科學基金資助項目（No. 9151063201000072）和汕頭市重點科技計劃項目（2008年度）

*通訊作者