張繼東 祝漢忠 紀曉軍* 周 縝 汪貫習(xí)

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021）

壯筋續(xù)骨湯對骨折大鼠血清BMP-7和IGF-1水平的影響和意義

張繼東 祝漢忠 紀曉軍* 周 縝 汪貫習(xí)

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東 青島 266021）

目的研究壯筋續(xù)骨湯對大鼠股骨骨折后骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-7）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）血清水平的變化，探討其促進骨折愈合的作用機制。方法成年健康雄性Wistar大鼠72只，用低速牙科鉆在股骨中段切斷股骨制備骨折模型，應(yīng)用壯筋續(xù)骨湯水煎液干預(yù)治療。X線觀察骨折局部愈合情況，組織病理學(xué)觀察骨痂結(jié)構(gòu)，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清BMP-7和IGF-1水平。結(jié)果大鼠骨折后7 d骨折斷端主要為纖維肉芽組織，14 d為纖維-軟骨性骨痂組織，21 d骨性骨痂增多，模型組與治療組未見顯著差異，28 d治療組骨痂重塑質(zhì)量明顯優(yōu)于模型組。大鼠術(shù)后7～21 d，治療組和模型組血清BMP-7和IGF-1水平無顯著性差異，術(shù)后28 d均顯著降低（P＜0.05），但治療組明顯高于模型組（P＜0.05）。結(jié)論壯筋續(xù)骨湯可能通過降低內(nèi)源性BMP-7和IGF-1降解，增強其活性，發(fā)揮促進骨折愈合的作用。

壯筋續(xù)骨湯；骨折；X線；BMP-7；IGF-1；大鼠

骨折創(chuàng)傷后機體細胞在分子水平的生物因子發(fā)生應(yīng)激性改變[1]，骨折端壞死骨細胞、成骨細胞以及被吸收的骨基質(zhì)均向周圍釋放內(nèi)源性生長因子[2]，并隨環(huán)境變化而調(diào)整影響骨折愈合進程[3]。在眾多細胞因子中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-7）[4]和胰島素樣生長因子-1（IGF-1）的作用尤為突出[5]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)以復(fù)位、固定、功能鍛煉等治療手段為主，祖國醫(yī)學(xué)治療骨折堅持動靜結(jié)合（固定與功能活動結(jié)合）、筋骨并重（骨折愈合與功能恢復(fù)并進）、內(nèi)外兼治（局部治療與整體治療兼顧）、醫(yī)患配合（醫(yī)療措施與患者主觀能動性配合）四大原則，療效顯著。傳統(tǒng)中藥治療骨折有其獨特的優(yōu)勢，有研究表明，大鼠股骨骨折后應(yīng)用壯筋續(xù)骨湯干預(yù)治療，可促進骨折愈合速度[6]，但觀察時間只有2周，未能全面反映骨折愈合的過程[7]。本實驗試圖進一步研究壯筋續(xù)骨湯促進骨折愈合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型和分組

成年健康雄性Wistar大鼠72只，體質(zhì)量230～250 g，清潔級，青島市藥物檢驗所動物中心提供。所有動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后隨機分為對照組、模型組、治療組各24只。用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉動物，俯臥位固定，常規(guī)消毒，無菌操作，取股外側(cè)切口，經(jīng)股前、外側(cè)肌間隔分離至股骨，對照組動物不切斷股骨，然后逐層縫合切口，噴灑青霉素注射液，無菌包扎。模型組和治療組動物分離暴露股骨后，在股骨中段（大轉(zhuǎn)子下1 cm）用低速牙科鉆（JBXNE22，NSK Co.Ltd.Japan）切斷股骨，然后行克氏針（直徑1 mm，上海醫(yī)用縫合針廠）髓腔逆行固定后逐層縫合，噴灑青霉素注射液，無菌包扎切口。術(shù)后即刻拍攝X線，后將動物放置籠中，每籠1只，單獨飼養(yǎng)。

1.2 治療方法

壯筋續(xù)骨湯配方根據(jù)清代趙濂《傷科大成》記載的壯筋續(xù)骨丹演化而來，由本院制劑室依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》制備。每副中藥充分煎煮兩次，使最終藥液達到224 mL，含生藥112 g，濃度0.5 g/mL。根據(jù)前期研究結(jié)果證實，每日1.25 g/kg較為理想[8]。本實驗以1.25 g/kg定量喂養(yǎng)，每日1次，連續(xù)28 d。對照組和模型組同步給予等量的生理鹽水。

1.3 評價指標

治療后7、14、21、28 d，每組各取6只動物觀察應(yīng)用以下方法觀察研究。①X線攝片：用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉動物，X線攝片，觀察骨痂結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)密度改變，判斷骨折愈合情況。②組織病理：頸椎脫臼處死動物，經(jīng)腹主動脈取血4 mL（備用），完整取出股骨，剔除多余軟組織，生理鹽水洗滌，置4%多聚甲醛中固定24 h，蒸餾水浸泡4 h，再置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣15 d。然后截取骨折處上、下1 cm部位的組織（包括血腫、骨痂組織），常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，沿股骨縱軸連續(xù)切片，厚5 μm，貼于載玻片。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察骨痂組織結(jié)構(gòu)。③酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：動物經(jīng)腹主動脈取血4 mL，4000 r/min離心10 min，分離血清2 mL，-20 ℃保存。采用雙抗夾心ELISA試劑盒（Blue Green公司）測定血清BMP-7和IGF-1水平。測定前室溫復(fù)溶，再次離心取上清標本100μL，按試劑盒說明書操作，用酶標儀（Bio-Rad 550型，美國）在450 nm測定BMP-7和IGF-1的吸光度值，根據(jù)樣品吸光度值在坐標上找出對應(yīng)的BMP-7（pg/mL）和IGF-1（ng/L）濃度。

圖1 大鼠骨折愈合的X線觀察（A對照組，B骨折7 d，C骨折14 d，D骨折21 d，E骨折28 d，F(xiàn)模型組，G治療7 d，H治療14 d，I治療21 d，J治療28 d）

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 X線觀察

X線片示，對照組大鼠股骨骨皮質(zhì)完整、連續(xù)（圖1A），模型組大鼠骨折當天骨折線清晰，骨皮質(zhì)連續(xù)性中斷（圖1F），骨折7 d（圖1B）骨折斷端被纖維性組織填充，但骨折線仍然明顯；至14 d（圖1C）纖維性骨痂開始形成，至21 d（圖1D）有鈣鹽沉著，至28 d（圖1E）骨性骨痂形成，骨小梁排列不規(guī)則。治療組大鼠骨折后7～21 d（圖1G、H、I），骨痂結(jié)構(gòu)變化與模型組相應(yīng)時間比較無明顯差異，但至28 d治療組骨痂結(jié)構(gòu)（圖1J）優(yōu)于模型組（圖1E），其皮質(zhì)骨及髓腔可辨，成像清晰。

2.2 HE染色

對照組大鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常（圖2A），模型組大鼠在骨折當天骨折端斷為血腫組織所填充（圖2F），骨折后7 d（圖2B）骨折斷端炎性細胞浸潤、纖維母細胞自骨膜下增生長入骨折間隙，形成纖維性肉芽組織，夾雜有少量的成骨細胞，治療組與模型組無明顯差異；至14 d（圖2C）骨折端纖維性組織生長，成骨細胞數(shù)目增多，纖維性骨痂生成，并有少量軟骨骨痂，治療組與模型組無明顯差異；至21 d（圖2D）破骨細胞、成骨細胞活躍，可見骨重塑腔隙、散在骨小梁形成，至28 d（圖2E）骨小梁清晰可見，排列規(guī)則，可見骨皮質(zhì)及骨髓腔。治療組骨架結(jié)構(gòu)在7～21 d（圖2G、H、I）與模型組相應(yīng)時間比較無顯著性差異，但至28 d治療組骨細胞排列相對整齊清晰（圖2J），顯著優(yōu)于骨折組（圖2E）。

2.3 酶聯(lián)免疫檢測

①血清BMP-7水平：從時間方面比較，對照組大鼠血清BMP-7水平在術(shù)后7～28 d未見顯著性變化（P＞0.05）。模型組和治療組大鼠血清BMP-7水平在術(shù)后7～21 d未見顯著性變化（P＞0.05），至28 d則顯著下降（P＜0.05）。組間比較：模型組和治療組大鼠血清BMP-7水平在術(shù)后7～28 d各時間點均顯著高于對照組（P＜0.05）；治療組大鼠血清BMP7水平術(shù)后7～21 d與模型組相應(yīng)時間點比較無顯著性差異（P＞0.05），但第28天仍顯著高于模型組和對照組（P＜0.05）。②血清IGF-1水平：對照組大鼠術(shù)后7、14、21、28 d血清IGF-1水平未見顯著性變化（P＞0.05）。模型組和治療組大鼠血清IGF-1水平在術(shù)后7、14、21 d無顯著性變化（P＞0.05），在28 d顯著下降（P＜0.05），均顯著高于對照組相應(yīng)時間點的水平（P＜0.05）。模型組和治療組比較，血清IGF-1水平在術(shù)后7～21 d無明顯差異（P＞0.05），但術(shù)后28 d治療組顯著高于模型組（P＜0.05）。

圖2 大鼠骨折處骨痂的病理學(xué)觀察，HE染色×200（A對照組，B骨折7 d，C骨折14 d，D骨折21 d，E骨折28 d，F(xiàn)模型組，G治療7 d，H治療14 d，I治療21 d，J治療28 d）

3 討 論

骨折愈合是一個復(fù)雜的骨再生、修復(fù)過程，有多種細胞因子參與。Urist等[1]首先發(fā)現(xiàn)了BMP，并由此提出了“誘導(dǎo)成骨”理論。BMP-7具有強烈的誘骨活性，通過誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osterix的表達，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，并協(xié)同其他調(diào)節(jié)因子參與骨組織的形成[4]。IGF-1是調(diào)節(jié)骨細胞功能和代謝的重要因子，能減少骨膠原退化、增加骨質(zhì)沉積，促進成骨細胞分化、成熟及補充[8，9]，并以劑量時間依賴性方式影響增生及功能代謝[10]。IGF-1與骨組織中的受體結(jié)合，發(fā)生受體自身磷酸化激活絡(luò)氨酸蛋白酶,促使胰島素受體底物磷酸化，從而調(diào)節(jié)軟骨細胞、骨細胞的生長、增殖與代謝[11-13]。骨生長因子生物活性大，生理作用強，能加速骨折愈合[14]，但是外源性細胞因子半衰期短，清除率高，不能持續(xù)有效地促進骨折愈合。中藥治療骨折除了解痙止痛、活血化瘀、去腐生肌等常規(guī)作用外，也直接或間接影響骨生長因子的分泌、降解和活性調(diào)節(jié)。研究顯示[15]，中藥治療骨折可通過提高外骨痂、聯(lián)接骨痂、橋梁骨痂、礦化骨痂的體積密度，從而增加骨骼強度，使骨痂拉伸強度、彎曲強度、抗折力等力學(xué)性能明顯增強。王力等實驗結(jié)果[16]顯示，用壯筋續(xù)骨湯體外培養(yǎng)骨細胞，S期細胞明顯增多，能促進成骨細胞增殖，說明壯筋續(xù)骨湯能促進成骨細胞DNA的合成，通過促進成骨細胞增殖來實現(xiàn)加快骨折愈合的作用。王祥杰等[8]動物實驗表明，壯筋續(xù)骨湯在骨折初期即能顯著提高實驗性大鼠血清BMP-7和NPY水平，促進實驗性大鼠骨折愈合。本次實驗結(jié)果顯示壯筋續(xù)骨湯在骨折術(shù)后第1～3周內(nèi)并未顯著提高大鼠血清中BMP7和IGF-1水平，在21 d后能使骨生長因子繼續(xù)保持較高水平，說明壯筋續(xù)骨湯并不能促進內(nèi)源性骨生長因子分泌，只起到增強內(nèi)源性因生物子活性、延長其半衰期、減緩內(nèi)源性BMP-7和IGF-1降解，發(fā)揮促進骨折愈合的作用。

[1] Urist MR,Delange RJ,Finerman GA.Born cell differentiation and growth factors[J].Science,1983,220(4598):680-686.

[2] Croteau S,Ranch F.Bone morphogenetic proteins in orthopedics: from basic science to clinical Practice[J].Orthopedics,1999,22(7):686-695.

[3] Tatsuyama K,Maezawa Y.Expression of various growth factors for cell proliferation and cylodifferentiation[J].Eur J Histochem, 2000,44(3):269-278.

[4] Kwong FN,Hoyland JA.Altered relative expression of BMPs and BMP inhibitors in cartilaginous areas of human fractures progressing[J]. Orthop Res,2009,27(6):752-757.

[5] Raschke M,Wildeman B.Insulin-like growth factor 1 andtransforming growth factor-beat 1 accelerates osteotomy healing using implants[J].Bone,2002,30(1):144-151.

[6] Guo YL,Wang XJ.ZJXG Decoction promotes the expression of bone morphogenetic protein-7[J].J Trauma Treat,2012,1(1):1-4.

[7] Pan YX,Wang XJ.Zhuang Jin Xu Gu Decoction improves fracture healing in rats by augmenting the expression[J].J Dent Med Med Sci,2012,3(8):517-521.

[8] 王祥杰,潘月興.壯筋續(xù)骨湯對大鼠骨折骨痂中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7和神經(jīng)肽Y表達的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(8):2420-2422.

[9] Kurland ES,Rosen CJ.Insulin-like growth factor-I in men with idiopathic osteoporosis[J].J Clin Endocrinol Metab,1997,82(2):279-286.

[10] 劉剛,胡蘊玉.胰島素樣生長因子-I對兔關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖及代謝的影響[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2002,16(3):228-230.

[11] Schmidmaier G,Wildemann B.Long-term effects of local growth factor treatment on fracture healing[J].J Orthop Res,2004,22(3):514-519.

[12] Wildemann B,Bambad P.Local delivery of growth factors from coat titanium plates increases osteotomy healing[J].Bone,2004, 34(5):862-868.

[13] 王敏,辛海霞.胰島素樣生長因子對成骨細胞生長影響的實驗研究[J].中國矯形外科雜志, 2004,12(3):236-238.

[14] Westerhuis IL,Van Bezooijen RL,Klcen P.Use of bone morphogenetic proteins in traumatology[J].Injury,2005,36(12):1405-1412.

[15] 黃佩軍.壯筋續(xù)骨湯聯(lián)合鎖定加壓鋼板內(nèi)固定治療脛骨平臺骨折療效觀察[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2012,31(14):20-21.

[16] 王力,涂宏.壯筋續(xù)骨湯含藥血清體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞的增殖[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(37):6959-6962.

The Effect and Significance of ZJXG Decoction on the Serum Levels of BMP-7 and IGF-1 in Femur Fracture Rats

ZHANG Ji-dong, ZHU Han-zhong, JI Xiao-jun*, ZHOU Zhen, WANG Guan-xi
(Institute of Integrative Medicine, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Zhuang Jin Xu Gu Decoction(ZJXG Decoction) on serum levels of bone morphogenetic protein-7(BMP-7)and insulin-like growth factor-1 (IGF-1)and to explore its promoting healing of femoral fracture in rats.MethodsFemur fractures were generated in 72 male adult Wistar rats by cutting femur transversely at middle point. ZJXG Decoction was administered orally after surgery for 7-28 d. The healing process was analyzed by X-ray and hematoxtlin-eosin(HE)staining in rats. The serum levels of BMP-7 and IGF-1 were detected by enzyme linked immunobsorbent assay(ELISA).ResultsX-ray imaging indicated that the fibrous callus tissue at the femoral fracture-end increased and the fracture line became fuzzy at 7-14 d following treatment with ZJXG Decoction. HE staining showed that the fibrous-granular tissue at the fracture-end changed gradually to fibrous, cartilaginous and osseous callus tissues. ELISA results showed that the serum levels of BMP-7 and IGF-1 increased significantly 28 days following treatment with ZJXG Decoction.ConclusionIt is concluded that ZJXG Decoction could enhance the fracture healing by reducing the decomposition of BMP-7 and IGF-1 and enhancing their activities.

ZJXG decoction; fracture; X-ray; BMP-7; IGF-1; rats

R683

B

1671-8194（2014）24-0008-03

*通訊作者