王善輝，謝金文，王文秀，成子強

（1.江蘇省徐州生物工程職業(yè)技學院，江蘇 徐州； 2.山東省農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，山東 泰安；3.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院重點實驗室，山東 濱州 256600）

新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的禽類烈性傳染病，可導致雞群大量發(fā)病和死亡，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將ND列為法定報告?zhèn)魅静　DV是副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬的成員，為有囊膜的單股、負鏈RNA病毒[1]。病毒基因組全長15 kb，編碼6種蛋白，其中F蛋白是NDV主要糖蛋白之一，具有良好的免疫原性，能提供免疫保護作用。NDV復制時，病毒粒子產(chǎn)生無活性前體蛋白（F0），在宿主細胞蛋白酶作用下，F(xiàn)0前體裂解成兩個由二硫鍵相連的多肽F1和F2[2]，使子代病毒有感染性。F0裂解位點的氨基酸順序直接影響其裂解能力，從而表現(xiàn)毒力的強弱[3-5]。為此，本研究對江蘇省不同地區(qū)分離的NDV分離株JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA株的F蛋白基因進行克隆測序，與國內(nèi)外常見疫苗株進行核苷酸、氨基酸同源性比較，并繪制進化樹，旨在進一步從分子水平上探索 NDV分離株與疫苗株和國內(nèi)外毒株之間存在的遺傳性關系，以進一步了解病毒的演化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌種和載體 所用NDV分離株JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA株系分離于該地區(qū)的某雞場產(chǎn)蛋雞；大腸桿菌DH5α由本室保存；pMD18-T戴體購自Takara 公司。

1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA Marker、dNTP、RNasin、DNA純化回收試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；無特定病原體（SPF）雞胚，購自山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所；Trizol試劑、DEPC（焦碳酸二乙酯）購自上海生物工程有限公司。

1.3 引物設計與合成 根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的NDV F基因核苷酸序列，應用DNAMAN軟件設計一對引物，在其易發(fā)生變異位點合成簡并堿基。引物序列分別為：

P1：5'-ATGGGCTCY（C/T）AR（A/G）ATCTTCTACC-3’

P2：5'-CGTTCATR（G/A）CTY（C/T）TTGTR （A/G）GTGGCTCTC-3’

1.4 病毒增殖 取10日齡SPF雞胚，尿囊腔接種病毒（每枚接種1000倍稀釋病毒液100μL），37℃溫箱孵育。收集接毒24h后死亡雞胚的尿囊液，并測定其血凝效價，具體操作見文獻[5]。

1.5 病毒RNA提取 分別取NDV分離株尿囊液各400μL，以10000r/min離心10min，取上清，加入等體積Trizol液，根據(jù)Trizol RNA提取試劑說明書提取病毒基因組。

1.6 F基因的RT-PCR擴增 將提取的RNA溶于DEPC水，加入引物P1，按AMV使用說明書進行反轉(zhuǎn)錄，滅活后進行PCR擴增，條件為：95℃預變性5 min； 95℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)擴增。

1.7 F基因的純化和克隆 電泳后切膠回收PCR產(chǎn)物，具體操作見DNA純化回收試劑盒說明書。然后與pMD18-T載體于16℃連接2h，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，酶切鑒定無誤后送上海生工測序。

1.8 F基因序列測定與氨基酸序列分析 應用DNAMAN對所測得NDV地方株F基因序列與國內(nèi)外有代表性參考毒株相應的核苷酸和氨基酸序列進行同源性比較和分析，應用DNAStar軟件繪制遺傳系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié) 果

2.1 分離株F基因cDNA 的RT-PCR擴增

從新城疫病毒分離株JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA尿囊液中提取的RNA用RT-PCR方法進行擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果4株NDV分離株均擴增出一條約1662bp的特異性條帶，與預期設計的擴增片段大小相符（圖1）。

圖1 NDV分離株F基因RT-PCR結(jié)果

2.2 分離株F基因重組質(zhì)粒的鑒定

將重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示擴增出一1662bp的片段，與RT-PCR的結(jié)果相一致（圖2）；將PCR鑒定大小相符的重組質(zhì)粒再經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，可見兩條大小分別為1662bp和2692bp左右的條帶，與預期結(jié)果相一致，表明所擴增的F基因片段均已經(jīng)定向克隆入載體中（圖3）。

圖2 NDV分離株F基因連T載體菌落PCR鑒定結(jié)果

圖3 NDV分離株F基因連T載體雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 F基因序列測定與氨基酸序列推導

重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，4個分離株F基因均包含了完整的開放閱讀框，共1662bp，編碼553個氨基酸。應用DNAMAN軟件推導出相應的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)在JSSZ和JSXZ 兩個分離株在其裂解位點的氨基酸序列為112-R-R-Q-K-R-F-117，符合強毒株裂解區(qū)氨基酸組成的特征；而JSHA和JSLYG兩個分離株的112至117位氨基酸序列與強毒株的征性氨基酸序列不相符，且與MDT和ICPI的測定結(jié)果相吻合。

2.4 F基因核苷酸及氨基酸序列同源性比較

4個NDV分離株F基因之間的核苷酸序列同源性不高，為73.3%～94.9%（平均87.65%）；氨基酸同源性為74.2%～100%（平均85.96%）；4個NDV分離株F基因與國內(nèi)標準強毒株F 48E9株之間的核苷酸序列同源性較低，為57.3%～68.4%（平均64.83%），但氨基酸同源性稍高，為79.7%～83.9%（平均81.73%）；4個NDV分離株F基因與常見疫苗株 LaSota株之間的核苷酸序列同源性也不高，為69.3%～80.8%（平均75.03%）。氨基酸同源性較差別較大，其中JSLYG株與LaSota株的氨基酸同源性較高，為98.3%；JSSZ株和JSHA株與LaSota株的氨基酸同源性分別為92.4%和92.7%；JSXZ株與LaSota株的氨基酸同源性最低，為78.2%。

2.5 F基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析

圖4 NDV F基因核苷酸同源性比較

圖5 NDV F基因氨基酸同源性比較

圖6 NDV各分離株在系統(tǒng)發(fā)育進化樹中的地位

應用DNA Star分析軟件將獲得的4株NDV分離株以及其他幾十株國內(nèi)外有代表性的 NDV毒株的F基因，均截為374bp（從ATG起～374bp）長度，繪制NDV F基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖6）。從進化樹的結(jié)果來看，NDV可分為9個基因型（Ⅰ～Ⅸ），所克隆的4個分離株中，JSXZ株與登錄號為AF358788的臺灣分離株位于同一個分枝上， 與JSSZ株遺傳關系最近，為基因Ⅷ型；JSLYG與JSHA株同在一個分支上，與Clone-30株遺傳關系最近，為基因 Ⅸ 型，也是國內(nèi)流行的基因型。

3 討論

NDV F基因的遺傳變異與NDV的變異和流行密切相關，是NDV分子流行病學研究的首選基因。F蛋白是構(gòu)成NDV致病性的分子基礎，NDV復制時，病毒粒子產(chǎn)生無活性前體蛋白（F0），在宿主細胞蛋白酶作用下，F(xiàn)0前體裂解成兩個由二硫鍵相連的多肽F1和F2，使子代病毒有感染性。F蛋白能否被裂解取決于F蛋白的裂解位點區(qū)（112-117）處氨基酸組成和宿主細胞的特性，F(xiàn)0裂解位點堿性氨基酸殘基的多少與病毒的毒力相關，由于強、弱毒株裂解位點的差異，使其對酶裂解的敏感性不同。本研究成功克隆了NDV JSXZ、JSSZ、JSLYG和JSHA毒株的F基因，將其克隆至pMD18 T載體中，并進行測序和遺傳進化樹分析。為從分子生物學角度分析江蘇省新城疫病毒變異情況打下良好的基礎，同時也為新城疫的診斷與防治方法的研究打下堅實的基礎，為控制本病的蔓延提供了可靠的理論依據(jù)。從4個毒株的F基因測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在JSSZ和JSXZ 2個分離株在其裂解位點的氨基酸序列為112-R-R-Q-K-R-F-117，符合強毒株裂解區(qū)氨基酸組成的特征；而JSHA和JSLYG兩個分離株的112至117位氨基酸序列與強毒株的征性氨基酸序列不相符，且與MDT和ICPI的測定結(jié)果相吻合。

對所分離NDV的4個江蘇分離毒株的F基因序列比對分析結(jié)果表明，4個毒株之間的核苷酸序列同源性不高，為73.3%～94.9%；4個毒株與常用國內(nèi)標準強毒株F48E9株之間的核苷酸序列同源性較低，為57.3%～68.4%，說明分離毒株與標準強毒株F48E9株存在致病性差異；與常用疫苗株LaSota株之間核苷酸序列同源性也只有69.3%～80.8%，這揭示我國不同年代、不同省區(qū)分離的NDV毒株之間以及與疫苗毒株之間在基因水平存在較大差異，這種差異對氨基酸及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有一定影響，很可能是造成弱毒株免疫效果不確實的一個重要原因。

最初，研究者根據(jù)NDV F基因全長序列分析繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)F基因的1～374位的核苷酸序列具有很好的代表性，根據(jù)其繪制的進化樹和全長序列繪制的完全一致，并且與當?shù)氐牧餍胁W資料符合性很好，是進行ND分子流行病學研究的良好材料[6-8]。所以本研究以分離的4個NDV江蘇毒株F基因的1～374bp的核苷酸序列繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，從進化樹的結(jié)果來看，NDV可分為9個基因型（Ⅰ～Ⅸ），所克隆的4個分離株中，JSXZ株與AF358788的臺灣分離株在同一個分支上，和JSSZ株遺傳關系最近，為基因Ⅷ型[9]；JSLYG與JSHA株同在一個分支上，與Clone-30株遺傳關系最近，為基因 Ⅸ 型，也是國內(nèi)流行的基因型。

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