彭永剛，于 倩，劉建華

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001；2.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙門氏菌是一種腸道桿菌，廣泛存在于各種動物及其環(huán)境之中。沙門氏菌病不僅是影響當今養(yǎng)禽業(yè)的主要細菌性疾病[2]，也是一種人畜共患性疾病，可導致嚴重的食品安全問題[3]。以肺部感染為特征的疾病主要危害 20 日齡以內(nèi)的雞群[4]，0～12 日齡為發(fā)病死亡高峰期[5]。到30 日齡以后 ，癥狀逐步減輕或消失 ，但遺留的弱殘雞 ，使育雛期淘汰率增加。因此，雞舍環(huán)境條件差、密度大、通風不良、飼料配合不當、營養(yǎng)缺乏等亦可引起本病的發(fā)生。

本研究從新疆烏魯木齊某養(yǎng)雞場暴發(fā)的病例的送檢病料中分離到一株疑似沙門氏菌，經(jīng)PCR、生化實驗和動物回歸實驗確診為雞白痢沙門氏菌，并對其進行了藥敏試驗，以期為該病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

采自某雞場，臨床表現(xiàn)為精神萎頓，食欲減少，同時腹瀉，排稀薄如漿糊狀糞便，有的病雛出現(xiàn)眼盲，或肢關(guān)節(jié)呈跛行癥狀的患病雛雞。剖檢可見肝腫大，充血或有條紋狀出血，有的心肌、肺、肝、盲腸、大腸及肌胃肌肉中有壞死灶或結(jié)節(jié)。具有明顯病變雛雞的肝臟、心臟、肺等組織作病原分離。

1.1.2 試驗材料

普通瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基（TSI）、蛋白胨、葡萄糖蛋白胨、V-P試劑、M-R試劑、藥敏試紙均由雞場微生物實驗室提供，以上試劑均在有效使用期內(nèi)；rTaq、dNTP購自大連寶生物公司；Animal Tissue Direct PCR Kit購自成都福際生物技術(shù)有限公司；實驗動物20 日齡以內(nèi)的SPF雛雞購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng)

采集病、死雞的肝臟、心臟、肺等組織，接種在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 18-24h。

1.2.2 涂片、革蘭氏染色及鏡檢

取新鮮可疑菌落，進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。

1.2.3 藥敏試驗

用滅菌棉拭子蘸取該分離菌營養(yǎng)肉湯純培養(yǎng)物，在普通瓊脂培養(yǎng)基表面反復涂布3次，室溫干燥3-5 min。后用無菌小鑷子將上述抗菌藥物紙片分別貼于培養(yǎng)基表面（每換一種紙片都要滅菌一次鑷子），37 ℃ 培養(yǎng)24 h。根據(jù)藥敏紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小來判斷該菌對各種藥物的敏感程度，分為高度敏、中度敏感、低度敏感、不敏感（耐藥）沒有抑菌圈。

1.2.4 生化實驗

將分離到的菌按常規(guī)方法進行三糖鐵試驗、吲哚試驗、MR試驗和 VP試驗以及多種糖發(fā)酵試驗。

1.2.5 PCR鑒定

參照文獻[6]，設(shè)計合成沙門氏菌invA基因核苷酸序列引物：invA1：5’-CGGTGGGGTTT GTTGTCTTTTC-3’，invA2： 5’-TCTCTTTCCA GTTCGCTTCGCC-3’、擴增產(chǎn)物長度為202 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR方法參見文獻[6]，PCR產(chǎn)物用Dye terminator Cycle Sequecing Quick Start Kit進行測序反應。應用DNAStar分析軟件進行序列的數(shù)據(jù)編輯，并對測序基因的核苷酸進行分析。

1.2.5 動物回歸實驗

取健康雛雞接種后觀察并記錄發(fā)病情況及死亡時間 ，取接種雞的肝及心血進行病原的再分離。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性結(jié)果

在瓊脂培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，肉眼可見形成圓形、隆起、灰白色的半透明菌落。經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)該分離菌為無芽孢、直桿狀革蘭氏陰性桿菌（圖1）。

圖1 沙門氏菌菌落形態(tài)

2.2 生化實驗結(jié)果

生化實驗結(jié)果見表1。由表中結(jié)果可見其生化特性與雞白痢沙門氏菌相符。

表1 沙門氏菌生化試驗結(jié)果

2.3 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥敏紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，本實驗經(jīng)藥敏試驗結(jié)果顯示，分離得到的沙門氏菌對慶大霉素，氯霉素高度敏感；對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、青霉素、復方新諾、痢特靈低敏。

2.4 PCR結(jié)果與分析

應用設(shè)計的引物，參照Animal Tissue Direct PCR Kit操作說明進行PCR，實驗結(jié)果顯示在約200bp出現(xiàn)目的條帶，與預期大小相符（圖2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序分析顯示其與GENEBANK中登錄的雞白痢沙門氏菌invA基因序列同源性99.7%。初步判定其為沙門氏菌。

圖2 PCR結(jié)果

2.5 動物回歸試驗結(jié)果

將培養(yǎng)菌液接種于雛雞24 h后，出現(xiàn)精神不振、食欲減退等癥狀，最后死亡。解剖死亡雛雞，主要病變有： 肝臟腫大，質(zhì)脆、出血、呈土黃色，有粟粒大灰白色壞死灶，膽囊擴張，脾臟腫大、出血，卵黃吸收不良，肺臟充血，出現(xiàn)肺炎等病理變化，將所分離細菌接種后，24h后長出與前述分離菌特征一致的細菌。

3 討論

雞的沙門氏菌病在各日齡均可感染，沙門氏菌還能垂直傳播。若種雞帶菌，則所產(chǎn)種蛋也可帶菌，因此孵化場在種蛋孵化前應對種蛋外殼嚴格進行消毒處理。為防止因雛雞帶菌在注射疫苗時的交叉感染，因此建議在免疫過程中盡量做到一只雞（或一個最小單位的雞群）用一個針頭[7]，以減少病菌的傳播。

本病的發(fā)生與飼養(yǎng)管理有密切關(guān)系 ，如雛群擁擠、溫差過大、通風不良、飼料營養(yǎng)不全等均可引發(fā)本病。建議加強飼養(yǎng)管理、注意環(huán)境衛(wèi)生 ，并做好隔離、封鎖和消毒工作。購買雛雞一定要對孵化場進行考察了解，不要向近期有沙門氏菌污染的孵化場購買雛雞，而且對購進的雛雞應進行精心管理，發(fā)現(xiàn)死雛，及時檢查，查找死亡原因。對已感染沙門氏菌的雞，要采取果斷措施[8]。作為種雞場，如果飼養(yǎng)數(shù)量不是很多，應全群淘汰，并對雞舍、場地、用具等進行徹底清掃，消毒殺菌，雞舍空置2周以上才能引進下一批雞。商品雞場若發(fā)現(xiàn)有沙門氏感染雞，應及時淘汰病雞，對未發(fā)現(xiàn)病雞進行藥物預防。感染沙門氏菌的成年雞雖然能夠產(chǎn)蛋，但所產(chǎn)雞蛋可能帶菌[9]，因此要進行殺菌處理，方可出售。

本研究通過PCR克隆了沙門氏菌invA基因序列，該基因高度保守，可作為沙門氏菌的鑒別檢測，通過序列分析發(fā)現(xiàn)其與雞白痢沙門氏菌invA基因高度同源，可初步判定分離得到的菌株為雞白痢沙門氏菌。本實驗進一步通過生化實驗，對照沙門氏菌生化特征，證實了該菌為雞白痢沙門氏菌。動物回歸實驗要注意接種動物的各種變化，做到勤觀察，包括呼吸狀態(tài)、呼吸式等，對死亡的實驗雞只要及時剖檢并做相關(guān)實驗室檢測。將該菌分離培養(yǎng)后接種雛雞，通過動物回歸實驗證實實驗動物臨床特征和剖檢病理特征符合該雞場患病雛雞的發(fā)病特征，從而證實本實驗分離得到的菌種為該雞場暴發(fā)疾病的病原菌。

在實驗過程中，要嚴格按照實驗室相關(guān)要求操作。在配制培養(yǎng)基過程中，要嚴格按照培養(yǎng)基使用說明配制，必須徹底滅菌，不得含有任何活細菌，否則配制的培養(yǎng)基無法達到預期使用效果[10]。藥敏實驗過程中，用滅菌接種環(huán)致密劃線于瓊脂平板表面時用力要均勻，接種細菌量不能過大。將確定好的藥敏紙片分貼到平板表面時，每個紙片都應輕壓一下，以保證與平板表面完全接觸[12]。藥敏實驗結(jié)果顯示分離的沙門氏菌對慶大霉素、氯霉素高度敏感，是治療該病的首選抗生素。

實驗結(jié)果確診了該雞場暴發(fā)的疾病病原為雞白痢沙門氏菌，同時通過藥敏試驗得出了防治該病的有效抗生素。本實驗為雞白痢沙門氏菌病的防治提供參考。

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