陳進(jìn)喜，張華智，黃 梅，鄭彥梓，翟成兵，熊 毅，鄭 敏，施開(kāi)創(chuàng)

（1.欽州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 欽州 535099；2.欽州市畜牧站，廣西 欽州 535099；3.廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001）

禽流感（avian inf l uenza，AI）是由正黏病毒科的A型流感病毒（inf l uenza A viruses）引起的一種禽類(lèi)的感染和/或疾病綜合癥，對(duì)家禽造成嚴(yán)重的危害。自1966年首次分離到H9N2亞型禽流感病毒以來(lái)，該型病毒目前已經(jīng)普遍存在于世界各國(guó)的禽群中，流行毒株可分為北美及歐亞兩種系[1]。1994年陳伯倫等[2]報(bào)道了中國(guó)大陸的首例禽流感病毒感染并從廣東雞群中分離到了H9N2亞型禽流感毒株。2003年分離到的人H9N2禽流感病毒（A/Hong Kong/2108/03）是一個(gè)新的重組體，很可能來(lái)源于當(dāng)?shù)氐幕钋菔袌?chǎng)[3]。AIV存在著廣泛的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，其抗原變異頻率很高，而在A(yíng)IV所編碼的各種蛋白質(zhì)中，又以HA基因的突變頻率最高；HA還是AIV中最主要的保護(hù)性抗原。本研究采集活禽交易市場(chǎng)臨床健康雞的氣管和泄殖腔的棉拭子，對(duì)其進(jìn)行H9亞型禽流感檢測(cè)，并擴(kuò)增HA基因序列，力圖闡述欽州地區(qū)H9N2禽流感HA基因的分子遺傳規(guī)律。為研究禽流感病毒的分布以及控制禽流感的流行、蔓延提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒

研究樣品采自欽州市活禽交易市場(chǎng)臨床健康雞的氣管和泄殖腔棉拭子，由廣西區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存； 陽(yáng)性對(duì)照：禽流感（H5+H9）二價(jià)滅活疫苗，青島易邦生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 SPF雞胚

9-11日齡無(wú)特定病原（SPF）雞胚由山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心提供。

1.3 引物

參考GenBank上已發(fā)表并上傳的H9N2亞型基因序列，選擇保守區(qū)域應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物：H9亞型分型用的引物：H9F：5’-CTYCACACAGARCACAATGG-3’；H9R：5’-GCCACACTTGHGGTRTC-3’；擴(kuò)增HA基因片段全長(zhǎng)用引物：HA1：5’-GGGGAAT TTCACAACCACTCAAG-3’；HA2：5’-TTGAGT AGAAACAAGGGTGTTTC-3’；反轉(zhuǎn)錄用引物Uni12：5’-AGCRAAAGCA-GG-3’。

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR

按試劑盒操作說(shuō)明提取病毒總RNA。以總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄引物Uni12進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積25 μL： 內(nèi)含模板2.0 μL，加10×Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）2.0 μL，Taq DNA酶（5 U/μL）0.25 μL，MgCl2（25 mmol/L）1 μL，上下游引物（25 pmol/μL）各0.5 μL，加ddH2O至25 μL，置PCR儀中。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，（H9亞型分型用57 ℃、擴(kuò)增HA基因片段全長(zhǎng)用54 ℃）45 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物7 μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統(tǒng)中觀(guān)察結(jié)果。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析

回收PCR產(chǎn)物中目的片段，回收目的DNA按連接試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂平板，培養(yǎng)16 h，挑斑接種于LB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床培養(yǎng)16 h；取1.0 mL培養(yǎng)物抽提重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切及PCR鑒定，將陽(yáng)性菌株送寶生物工程（大連）公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的基因序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 H9亞型禽流感病毒PCR檢測(cè)結(jié)果

用H9亞型禽流感病毒分型引物對(duì)臨床健康的雞棉拭子進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)488 bp大小的片段確定為H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性（圖1）。所采集的樣品中有1份為H9亞型禽流感病毒陽(yáng)性（命名為：A/Chicken/Guangxi/qz40/2009，簡(jiǎn)稱(chēng)qz40）。

圖1 H9亞型禽流感病毒PCR檢測(cè)結(jié)果圖

2.2 病毒的增殖和純化

將H9亞型禽流感病毒PCR檢測(cè)陽(yáng)性的棉拭子經(jīng)雙抗處理后8000 r/min離心10 min，取上清液接種9 ～ 11日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜（0.2 mL/胚），37 ℃孵育，間隔6 ～ 12 h照胚一次，死胚置4 ℃過(guò)夜，無(wú)菌收集24 ～ 96 h死亡的雞胚尿囊液，用1%的雞紅細(xì)胞測(cè)定其血凝效價(jià)。然后根據(jù)血凝效價(jià)進(jìn)行10-1000倍有限稀釋后繼續(xù)接種SPF雞胚，至少傳3代，收獲血凝滴度≥7log2的尿囊液于 -70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 HA基因的PCR擴(kuò)增

應(yīng)用HA1/HA2引物擴(kuò)增出qz40株的HA基因全長(zhǎng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳分析表明，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）?；厥誔CR產(chǎn)物中目的片段，連接、轉(zhuǎn)化、挑斑，將酶切及PCR鑒定陽(yáng)性的菌株進(jìn)行測(cè)序。

圖2 HA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.4 序列測(cè)定及同源性分析

將所獲qz40株的HA基因核苷酸序列的測(cè)序結(jié)果拼接后（圖3），HA基因的cDNA包括一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，編碼區(qū)由1683 bp組成，共編碼560個(gè)氨基酸，包括信號(hào)肽（1aa – 18aa）、HA1（19aa – 337aa）、HA2（339aa – 560aa） 和一個(gè)精氨酸（338aa）。經(jīng)DNAStar軟件將所獲毒株的HA基因序列與從GenBank中獲得的26個(gè)H9N2亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，由表1可知，qz40株與A/chicken/Guangxi/21/2006株的核苷酸同源性最高，達(dá)99.9%，與A/Duck/HongKong/Y439/97株的核苷酸同源性最低，僅為82.8%；推導(dǎo)的氨基酸同源性介于87.5% ～ 99.6%之間。

2.5 功能位點(diǎn)分析

推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，qz40株含有7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser/Thr，X為除Pro以外的任意氨基酸），其中5個(gè)位于HA1部分，為NST（29aa-31aa）、NVS（141aa-143aa）、NRT（218aa-220aa）、NTT（298aa-300aa）、NVS（305aa-307aa）；2個(gè) 位 于 HA2部 分， 為NGT（492aa-494aa）、NGS（55laa-553aa）。 裂解位點(diǎn)序列（335aa-341aa）分析發(fā)現(xiàn)，該毒株為RSSR↓GLF，為非高致病力毒株的典型特征，對(duì)禽類(lèi)為低致病力。構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸位于 109aa、161aa、163aa、191aa、198aa、202aa、203aa（qz40株的受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸依次YWTNTLY），通過(guò)與其他參考毒株相比，198位氨基酸變化較大，其中本研究的qz40株為T(mén)，而A/Chicken/Beijing/1/94為 V，A/Quail/HongKong/G1/97和A/Duck/HongKong/Y439/97都為E，其它位點(diǎn)的氨基酸相對(duì)保守。

圖3 qz40株HA基因測(cè)序結(jié)果

表1 qz40株HA基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與其他H9N2毒株的比對(duì)（%）

2.6 進(jìn)化樹(shù)分析

基于H9亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖4）。從進(jìn)化樹(shù)可以分為3個(gè)群系，分別為：A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1-like）和A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）。從本研究建立的基于H9亞型HA基因進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，欽州分離的qz40株屬于A(yíng)/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）群系，與國(guó)內(nèi)參考株的親緣關(guān)系較近。而與A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）群系的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 HA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

禽流感病毒粒子表面有二種主要的纖突，分別為血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）。HA在病毒吸附及穿膜過(guò)程中起關(guān)鍵作用，能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體從而中和病毒的感染[4]。目前，在世界范圍內(nèi)的各種家禽和野禽中，按照HA的表面抗原來(lái)區(qū)分，有15種特異的HA（H1-H15）[5]。

本研究運(yùn)用H9亞型分型引物對(duì)采集的棉拭子進(jìn)行PCR篩選，選取PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品，接種SPF雞胚進(jìn)行病毒的增殖，通過(guò)有限稀釋克隆法純化3代后，獲得相對(duì)穩(wěn)定、血凝滴度較高（≥71og2）的種毒，分裝后保存于 -70℃?zhèn)溆?。本研究從采集自活禽交易市?chǎng)的臨床健康的雞棉拭子中獲得1份陽(yáng)性樣品，將其命名為A/Chicken/Guangxi/qz40/2009（簡(jiǎn)稱(chēng)qz40），在運(yùn)用特異引物擴(kuò)增包含HA全基因在內(nèi)的序列，并對(duì)其進(jìn)行序列的測(cè)定，測(cè)序結(jié)果拼接后顯示HA基因的cDNA包括一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，編碼區(qū)由1683 bp組成，共編碼560個(gè)氨基酸。經(jīng)DNAStar軟件將所獲毒株的HA基因序列與從GenBank中獲得的26個(gè)H9N2亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果顯示該毒株與參考毒株的核苷酸序列同源性為82.8%～99.9%，與A/chicken/Guangxi/21/2006株的核苷酸同源性最高；推導(dǎo)氨基酸同源性介于87.5%～99.6%之間。

HA上潛在的糖基化位點(diǎn)對(duì)病毒的受體親和力、病毒毒力等多種生物學(xué)特性有影響[6]。本研究中qz40株含有7個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，其中5個(gè)位于HA1部分、2個(gè)位于HA2部分，與其他參考株沒(méi)有太大的差異。本研究所得的qz40株的HA的裂解位點(diǎn)為RSSR↓GLF，沒(méi)有多個(gè)連續(xù)的堿性氨基酸插入，具有典型的低致病性禽流感病毒的基因特征[7]。流感病毒HA受體結(jié)合位點(diǎn)的特異性決定其感染的宿主范圍。當(dāng)病毒適應(yīng)新宿主時(shí)，決定受體結(jié)合特異性的234位氨基酸通常首先發(fā)生變化[8]。本研究的病毒在該位置為亮氨酸（L），而香港人源H9N2毒株該處氨基酸也為亮氨酸（L）。

研究表明H9N2禽流感主要由2個(gè)大的分支，歐亞種系和北美種系。歐亞種系又分為3個(gè)群系，分 別 為：A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）、A/Quail/HongKong/G1/97（G1-like） 和 A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）[1]。本研究中的欽州分離毒株qz40株屬于歐亞種系的A/Chicken/Beijing/1/94（Ck/Bei-like）群系，與國(guó)內(nèi)參考株的親緣關(guān)系較近，特別是與分離自廣西的毒株A/chicken/Guangxi/21/2006株處于同一小分支上，這與核苷酸同源性比對(duì)結(jié)果相符。而與A/Duck/HongKong/Y439/97（Y439-like）群系的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

H9N2亞型禽流感病毒雖在亞洲的許多國(guó)家流行，各毒株的親緣關(guān)系也較近，但有很多因素能影響其HA基因的變異，從而影響其致病力。已有研究表明來(lái)自于禽類(lèi)的H9N2禽流感病毒能偶爾從禽類(lèi)傳染給哺乳動(dòng)物，包括人和豬[9]。這種跨種間傳播表明目前的H9N2禽流感病毒對(duì)人仍有潛在的感染性。因人類(lèi)與家禽的接觸機(jī)會(huì)歷來(lái)很多，人類(lèi)與禽類(lèi)流感之間的聯(lián)系自然非常密切，加之1997年香港禽流感病毒對(duì)人類(lèi)的直接感染[10]，目前對(duì)禽流感的公共衛(wèi)生意義的認(rèn)識(shí)日益受到重視。在禽流感所編碼的各種蛋白質(zhì)中，又以HA基因的突變頻率最高， HA還是禽流感中最主要的保護(hù)性抗原，因此本研究就HA基因序列的測(cè)定，為H9N2亞型禽流感廣西分離株遺傳變異分析和分子流行病學(xué)調(diào)查提供了重要材料，也為制訂H9亞型禽流感的綜合防制措施提供了依據(jù)，因此建議臨床上在重視H5亞型禽流感感染控制的同時(shí)，還應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)H9亞型禽流感感染的防控。

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