方志超，周 磊，劉 偉，鄒立強，熊志強

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047）

多酚氧化酶（PPO）是一種廣泛存在于動物、植物中的含銅氧化還原酶[1]。近幾十年來研究發(fā)現(xiàn)：PPO在有氧條件下可催化酚類物質(zhì)氧化生成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)再進(jìn)一步聚合或與蛋白質(zhì)等作用生成褐色素或黑色素，從而引起果蔬品質(zhì)劣變和營養(yǎng)成分的破壞[2]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PPO活性的抑制與鈍化是當(dāng)前研究的熱點，其改性手段包括物理方法：如熱處理[3]、超聲處理[4]、靜高壓處理[5]以及動態(tài)高壓微射流處理[6]；化學(xué)方法：如抗壞血酸處理[7-8]、草酸處理[9]、L-蘋果酸[10]等。酸處理由于其操作簡單效果明顯，一直是商業(yè)上抑制和鈍化PPO活性的主要手段之一。Liu等[11]報道了檸檬酸對蘑菇PPO活性的抑制效果。Arzu Altunkaya等[9]報道了抗壞血酸、L-半胱氨酸、草酸和檸檬酸對萵苣PPO活性的抑制效果。Daroit等[12]報道了檸檬酸和抗壞血酸對薰衣草種子PPO活性的影響。

然而，當(dāng)前酸處理多酚氧化酶的相關(guān)報道主要集中于PPO活性和動力學(xué)方面，酸處理對PPO構(gòu)象影響的報道相對較少。本實驗以蘑菇PPO為原料，采用不同濃度的乳酸對其進(jìn)行處理，通過光譜手段（紫外、熒光）測定PPO的相對酶活性、巰基含量（SH）、熒光強度和紫外吸收的變化，嘗試為進(jìn)一步研究酶活性與構(gòu)象之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘑菇多酚氧化酶（活性700U/mg）美國Worthington Biochemical公司；磷酸二氫鈉、鄰苯二酚、磷酸氫二鈉 天津大茂化學(xué)試劑廠；乳酸 上海晶純實業(yè)有限公司。

PC-1600型紫外光光度計 上海美譜達(dá)公司；MOS-450型圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；F-7000型熒光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸對PPO溶液的處理 參照Liu等[11]的方法，略作修改。準(zhǔn)確稱取20.00mg PPO溶解于20mL 5mmol/L磷酸緩沖液（pH6.8）配制成PPO溶液，準(zhǔn)確量取10mL乳酸，用20mm/L磷酸緩沖液（pH6.8）定容到1L（100mm/L）作為母液，對其進(jìn)行不同程度的稀釋以獲得20、40、60、80、100mm/L的乳酸溶液。PPO溶液與不同濃度的乳酸溶液進(jìn)行等體積混合處理，最終乳酸溶度為10、20、30、40、50mm/L，PPO的最終質(zhì)量濃度為0.5mg/mL。

1.2.2 PPO活性的測定 參照Liu等[11]的方法，PPO活性在37℃、420nm波長處測定。反應(yīng)底物溶液包括0.2mL 20mmol/L的鄰苯二酚溶液與2.7mL 20mmol/L、pH6.8的磷酸緩沖溶液，該底物溶液預(yù)先在37℃的水浴鍋內(nèi)恒溫15min。然后將反應(yīng)底物分別與0.1mL不同濃度乳酸處理后的酶液（0.1mg/mL）迅速混合，立即于420nm波長處測定其吸光度，5min后再測定一次吸光度。每個樣品酶活平行測定3次。

酶活力的定義：單位時間內(nèi)，每毫升酶液吸光度變化0.001定義為1個酶活力單位。

相對酶活性（%）＝（處理后樣品酶活性/對照組樣品酶活性）×100。

1.2.3 巰基含量的測定 采用Ellinan實驗方法[13]測定PPO中的巰基含量：1mL PPO溶液加入到4mL含有0.05mL 0.01mol/L 5，5’一二硫硝基苯甲酸（DTNB）的磷酸鹽緩沖液中（0.1mol/L，pH8.0），經(jīng)過20min混合，在412nm處測量其吸光度，巰基含量是通過吸光度與摩爾消光系數(shù)13600的比值來獲得的。相對巰基含量（%）=（處理樣品的巰基含量/未處理對照樣品巰基含量）×100。

1.2.4 內(nèi)源熒光強度測定 采用F-7000型熒光光度計在（25±1）℃測量處理前后PPO的內(nèi)源熒光性。參照Liu等[11]的方法，做了部分修改。選用10mm口徑的方形石英進(jìn)行裝樣測定。設(shè)定激發(fā)波長（λex）為280nm，掃描波長（λem）范圍為290 ～450nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為5nm。

1.2.5 紫外光譜的掃描 采用PC-1600紫外光譜儀，在200～400nm范圍內(nèi)掃描得到吸收光譜。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

實驗均重復(fù)3次，取平均值。采用SAS軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度乳酸對PPO活性的影響

不同濃度乳酸對PPO相對活性的影響如圖1所示。當(dāng)乳酸濃度為0～10mmol/L時，PPO相對活性下降緩慢，乳酸濃度為10mmol/L時活性仍有95.63%，當(dāng)乳酸濃度為10～40mmol/L，PPO相對活性迅速下降，乳酸濃度為40mmol/L時活性僅為1.20%，當(dāng)乳酸濃度進(jìn)一步增大到50mmol/L時其相對活性為0.17%，PPO活性得到基本抑制。Daroit等[12]報道了檸檬酸和抗壞血酸對薰衣草種子PPO活性的影響，結(jié)果表明3mmol/L抗壞血酸處理后其相對活性為47%。Liu等[11]同樣發(fā)現(xiàn)PPO經(jīng)10mmol/L檸檬酸處理20min后相對酶活為82.0%，當(dāng)濃度繼續(xù)增大到60mmol/L時，PPO相對活性為4.3%，PPO活性得到顯著抑制。由此可知，低濃度的乳酸對PPO酶活性的抑制效果弱于抗壞血酸和檸檬酸，高濃度的乳酸對PPO酶活性的抑制效果強于檸檬酸，可能是由于PPO對不同有機(jī)酸的敏感度不同。乳酸濃度為40mmol/L時，PPO活性得到基本抑制，為最佳滅活處理濃度。

圖1 不同濃度乳酸對PPO相對活性的影響Fig.1 Residual activity of lactic acid treated PPO

2.2 不同濃度乳酸對PPO巰基的影響

圖2 不同濃度乳酸對PPO巰基含量的影響Fig.2 The effect of lactic acid on SH content of PPO

巰基和二硫鍵通常以活性功能基的形式參與到酶的催化、輔助因子的結(jié)合以及蛋白質(zhì)構(gòu)象的維持，因此研究巰基的數(shù)量和性質(zhì)是獲得某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息的重要手段。不同濃度乳酸對PPO巰基含量的影響如圖2所示。由圖2（A）可知，隨著乳酸濃度的不斷增加，相對巰基含量也相應(yīng)的減少。當(dāng)乳酸為10mmol/L其相對巰基含量沒有顯著變化；當(dāng)乳酸濃度為10～40mmol/L時，巰基含量下降較為明顯，當(dāng)乳酸濃度為40mmol/L時，其相對巰基含量為80.09%。由圖2（B）可知，相對酶活性的變化與相對巰基含量變化二者呈較好線性關(guān)系（R2=0.9861）。Liu等[14]報道動態(tài)高壓微射流130MPa處理其巰基含量為3.46×10-4mol/mg，150MPa處理其巰基含量降為3.35×10-4mol/mg（96.8%），其原因是由于高壓誘導(dǎo)巰基結(jié)合形成新的二硫鍵。Xu等[15]報道隨著溶液體系pH降低，銀鯉肌凝蛋白的表面自由巰基含量略有下降。乳酸降低PPO自由巰基的含量可能是由于隨溶液體系pH降低，分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，一定程度上增大了PPO表面自由巰基的作用概率而形成二硫鍵。PPO相對活性的降低與自由巰基含量的降低呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，這可能是由于自由巰基含量的降低使得PPO活性位點周圍的自由巰基參與了二硫鍵的形成。

2.3 不同濃度乳酸對PPO熒光強度的影響

圖3 不同濃度乳酸對PPO熒光發(fā)射光譜的影響Fig.3 The effect of lactic acid on fluorescence emission spectra of PPO

圖3為不同濃度乳酸對PPO熒光發(fā)射光譜的影響，隨乳酸濃度的不斷增大，PPO的熒光強度不斷降低。當(dāng)乳酸濃度為0 ～30mmol/L時，熒光強度下降很緩慢，當(dāng)乳酸濃度為30mmol/L時，PPO熒光強為原酶的94.24%，而隨乳酸濃度進(jìn)一步增加，熒光強度顯著降低，當(dāng)乳酸濃度為50mmol/L時，熒光強度為原酶的84.50%。經(jīng)10、20、30、40、50mmol/L乳酸處理后PPO最大熒光發(fā)射峰從346nm分別移動到347、347、347、349nm。這表明乳酸處理能破壞PPO三級結(jié)構(gòu)。Liu等[11]研究報道檸檬酸能夠引起PPO熒光強度的降低，當(dāng)檸檬酸濃度為60mmol/L時，其熒光強度為原酶77.3%，最大熒光發(fā)射波峰由341nm移動到344nm，與本實驗研究結(jié)果是一致。Si等[16]發(fā)現(xiàn)酪氨酸的熒光強強度隨著間苯二甲酸濃度的增大而降低。劉等[17]報發(fā)現(xiàn)1.00mmol/L苯甲酸處理蘑菇酪氨酸酶，其熒光強度下降為48.3%。Kanade等[18]報道McIlvaine緩沖液可以引起PPO三級結(jié)構(gòu)破壞。本實驗中，不同濃度乳酸處理后的PPO內(nèi)源性熒光強度的降低可能是由于乳酸誘導(dǎo)PPO分子構(gòu)象部分去折疊并破壞PPO分子三級結(jié)構(gòu)而引起。PPO三級結(jié)構(gòu)破壞的同時其酶活性發(fā)生不同程度的降低，這說明PPO活性與其三級結(jié)構(gòu)具有著一定的相關(guān)性。

2.4 不同濃度乳酸對PPO紫外吸收光譜的影響

圖4 不同濃度乳酸對PPO紫外吸收光譜的影響Fig.4 The effect of lactic acid on UV absorption spectra of PPO

生色基團(tuán)的變化伴隨著蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，因此可通過監(jiān)測生色基團(tuán)的變化來揭示蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。不同濃度乳酸對PPO紫外吸收光譜的影響如圖4所示，在280nm處PPO紫外吸收強度隨乳酸濃度的增大而減小。當(dāng)乳酸濃度為0～10mmol/L時，PPO紫外吸收強度降低緩慢，乳酸濃度進(jìn)一步增加到30mmol/L，PPO紫外吸收強度迅速下降，當(dāng)乳酸濃度繼續(xù)增加，PPO紫外吸收強度基本不變。Neamtu等[19]報道甲苯酰吡啶乙酸對人血清蛋白的影響，隨甲苯酰吡啶乙酸濃度的增加，人血清蛋白紫外吸收強度增加。許等[20]報道280nm處紫外吸收強度的變化產(chǎn)生于酶蛋白中暴露于分子表面的紫外生色基團(tuán)數(shù)量的增減，相應(yīng)于酶的構(gòu)象發(fā)生使某些生色基團(tuán)內(nèi)藏或外露的變化。本實驗中，PPO吸光強度的降低可能是乳酸誘導(dǎo)PPO分子生色基團(tuán)內(nèi)藏。低濃度時，PPO溶液體系pH變化較小，使得PPO分子生色基團(tuán)內(nèi)藏程度小，高濃度時，溶液體系pH偏離PPO最適pH，從而引起PPO分子生色基團(tuán)進(jìn)一步內(nèi)藏。PPO紫外強度降低的伴隨著其酶活性不同程度的降低，這說明PPO活性與其熒光強度有著一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論

乳酸是在食品工業(yè)中一種常用來抗褐變的有機(jī)酸。PPO的相對酶活性隨著乳酸處理濃度的增大而減小，當(dāng)乳酸濃度達(dá)到40mmol/L時，其活性已完全得到的抑制，其相對酶活性為1.20%；隨乳酸濃度的增大，相對巰基含量逐漸減小，相對巰基含量與酶活性呈現(xiàn)較好地線性關(guān)系（R2=0.9861）；紫外吸收光譜以及熒光發(fā)射光譜表明：不同濃度乳酸處理PPO可能引起PPO三級結(jié)構(gòu)的破壞，從而導(dǎo)致PPO活性的降低。

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