鄒 宇，胡立明，胡文忠，* ，何煜波，劉程惠

(1.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600;2.空軍勤務(wù)學(xué)院航空軍需系，江蘇徐州221006)

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)廣泛分布于自然界中，存在于肉類、乳制品、蛋類、海產(chǎn)品和蔬菜等大多數(shù)食品中［1－2］。單增李斯特菌是人畜共患病的病原菌，也是一種腐生菌，在某些食物(主要是肉類和乳制品)中易于生長(zhǎng)繁殖，能引起嚴(yán)重的食物中毒，主要表現(xiàn)為敗血癥、腦膜炎等［3－4］。該菌在 4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一［5］。牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富且配比合理，易受到單增李斯特菌的污染［6］，因此，研究單增李斯特菌在牛奶中的生長(zhǎng)情況對(duì)保障食品安全性是十分必要的。

食品預(yù)測(cè)微生物學(xué)是一門在微生物學(xué)、數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)上建立起來(lái)的新學(xué)科［7－8］，通過(guò)建立數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型，可定量分析不同環(huán)境條件(如溫度、濕度、含氧量等)下食品中病原菌和腐敗菌的數(shù)量，從而對(duì)食品中微生物的生長(zhǎng)情況作出合理預(yù)測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定5、15、25和35℃條件下單增李斯特菌在牛奶中的細(xì)菌總數(shù)并擬合生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線，進(jìn)而建立牛奶中單增李斯特菌生長(zhǎng)的初級(jí)模型和二級(jí)模型，為牛奶等食品在貯藏過(guò)程中對(duì)單增李斯特菌的預(yù)測(cè)和控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單增李斯特菌 由遼寧省食源性病原性微生物快速檢測(cè)與安全控制中心提供;牛奶 市售純牛奶，購(gòu)于大連本地超市;胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

MLS－3780高壓蒸汽滅菌器 三洋電機(jī)株式會(huì)社;海爾hrcj－1D超凈工作臺(tái) 青島海爾特種電器有限公司;DNP－9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;海爾HYC－326A醫(yī)用冷藏箱 青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將35℃活化15h后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單增李斯特菌接種于純牛奶(50mL牛奶/250mL三角瓶)中，使初始接種量達(dá)到3×103CFU/mL，考慮到牛奶常見(jiàn)貯藏溫度和建模均勻取值需要，將牛奶樣品分別放置于5、15、25和35℃恒溫冷藏箱和恒溫培養(yǎng)箱中貯藏，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。

1.2.2 細(xì)菌總數(shù)測(cè)定 無(wú)菌操作吸取樣品各5mL，分別放入裝有滅菌生理鹽水的三角瓶中，適當(dāng)稀釋，涂布于胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基表面，36℃培養(yǎng)24h，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定各樣品中的細(xì)菌總數(shù)［9］。

1.2.3 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型(初級(jí)模型)的建立 利用在5、15、25和35℃條件下測(cè)得的生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別擬合 Gompertz 方程［10］、Logistic 方程［10－11］和 Hill方程［12］，建立相應(yīng)的模型，并確定最優(yōu)的初級(jí)模型。

式中，t為時(shí)間，h;N(t)為t時(shí)的菌數(shù)，lg(CFU/mL);N0為初始菌數(shù)，lg(CFU/mL);a、b和 c為待定系數(shù)。

式中，t為時(shí)間，h;N(t)為t時(shí)的菌數(shù)，lg(CFU/mL);N0為初始菌數(shù)，lg(CFU/mL);a、b和 c為待定系數(shù)。

式中，t為時(shí)間，h;N(t)為t時(shí)的菌數(shù)，lg(CFU/mL);N0為初始菌數(shù)，lg(CFU/mL);a、b和 c為待定系數(shù)。

1.2.4 溫度對(duì)微生物影響的動(dòng)力學(xué)模型(二級(jí)模型)的建立 利用最優(yōu)初級(jí)模型(Gompertz方程)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)建立溫度對(duì)單增李斯特菌影響的二級(jí)模型。二級(jí)模型采用Belehradek方程，是由Ratkowsky等［13］根據(jù)微生物在0～40℃條件下，最大生長(zhǎng)速率或延滯時(shí)間倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的線性關(guān)系而提出的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

式中，T為溫度，℃;Vmax為溫度T時(shí)的最大生長(zhǎng)速率，h－1;Lag為溫度 T 時(shí)的延滯時(shí)間，h;dV、dLag、TminV和TminLag均為待定系數(shù)，其中 TminV和 TminLag為假定的微生物生長(zhǎng)的最低溫度，℃。

根據(jù)Gompertz方程可推導(dǎo)出［14］:最大生長(zhǎng)速率:Vmax=ac/e;延滯時(shí)間:Lag=(b－1)/c;最大菌數(shù):Nmax=N0+a。

1.2.5 生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證與可靠性評(píng)價(jià) 應(yīng)用建立的單增李斯特菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型來(lái)求得20℃條件下預(yù)測(cè)值，與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，并采用偏差度和準(zhǔn)確度來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的可靠性［15］。

式中，N預(yù)測(cè)為生長(zhǎng)模型的預(yù)測(cè)值，lg(CFU/mL);N實(shí)測(cè)為同一時(shí)間的實(shí)測(cè)值，lg(CFU/mL);n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次重復(fù)的平均值，采用SAS 8.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，采用Statistica 6.0進(jìn)行模型的擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 單增李斯特菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線和擬合的初級(jí)模型

將牛奶在5、15、25和35℃貯藏過(guò)程中得到的細(xì)菌總數(shù)值，分別采用Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程進(jìn)行擬合，得到的生長(zhǎng)曲線如圖1所示。

由表 1可知，在 5、15、25和 35℃ 條件下Gompertz方程擬合的模型 R2均大于同溫度下Logistic方程和Hill方程擬合的模型，且Gompertz方程擬合模型的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)均小于其它兩種模型，這表明Gompertz方程擬合的模型更接近于真實(shí)值，因此選擇Gompertz方程作為單增李斯特菌在牛奶中的最優(yōu)初級(jí)模型，并以此為基礎(chǔ)建立二級(jí)模型。

2.2 溫度對(duì)單增李斯特菌影響的動(dòng)力學(xué)模型(二級(jí)模型)

表2為不同溫度條件下Gompertz方程擬合的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的各項(xiàng)參數(shù)。隨著溫度的升高，最大菌數(shù)(Nmax)和最大生長(zhǎng)速率(Vmax)逐漸變大，而延滯時(shí)間(Lag)則逐漸縮短。最大生長(zhǎng)速率或延滯時(shí)間倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的線性關(guān)系，需要采用Belehradek方程進(jìn)行描述。

由圖2可知，最大生長(zhǎng)速率(Vmax)和延滯時(shí)間(Lag)倒數(shù)的平方根與溫度之間存在的良好的線性關(guān)系，模型的 R2分別為 0.9721和0.9747，這表明Belehradek方程更好的描述了不同溫度變化對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)的影響。溫度與最大生長(zhǎng)速率和延滯時(shí)間的Belehradek方程分別為:

圖1 單增李斯特菌在不同溫度條件下的生長(zhǎng)曲線和動(dòng)力學(xué)模型Fig.1 Growth curves and kinetic models of L.monocytogenes at different temperature

表1 不同溫度條件下單增李斯特菌在牛奶中的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型Table 1 Growth kinetics models of L.monocytogenes in milk at different temperatures

表2 單增李斯特菌在牛奶中生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的參數(shù)Table 2 Parameters of growth kinetics model of L.monocytogenes in milk

圖2 溫度與最大生長(zhǎng)速度和延滯時(shí)間的關(guān)系Fig.2 Relationship between temperature and Vmaxor Lag

由最大生長(zhǎng)速度和延滯時(shí)間的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的殘差分析(表3)可知，殘差值均小于0.06，這表明Belehradek方程建立的二級(jí)模型是可信的。

表3 溫度與最大生長(zhǎng)速度和延滯時(shí)間平方根模型的殘差分析Table 3 Residuals analysis of temperature and(Vmax)1/2or(1/Lag)1/2

表4 20℃條件下單增李斯特菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證與分析Table 4 Verification and analysis of growth kinetics prediction model of L.monocytogenes at 20℃

2.3 單增李斯特菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證與可靠性評(píng)價(jià)

為驗(yàn)證建立的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的有效性和可靠性，根據(jù)預(yù)測(cè)模型構(gòu)建20℃條件下單增李斯特菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程，比較同一時(shí)間的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值，并分析預(yù)測(cè)模型的偏差度和準(zhǔn)確度。采用李苗云等［9］和李除夕等［15］最大菌數(shù)的計(jì)算方法，20℃ 條件下最大菌數(shù)(Nmax)以15℃和25℃條件下最大菌數(shù)對(duì)數(shù)值的平均值為判斷指標(biāo)，由二級(jí)模型(Belehradek方程)計(jì)算出20℃時(shí)的最大生長(zhǎng)速率(Vmax)和延滯時(shí)間(Lag)，帶入修正后的Gompertz方程，求得20℃條件下單增李斯特菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型(初級(jí)模型)為:

由表4可知，20℃條件下生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的殘差值均小于0.2，偏差度為1.04，準(zhǔn)確度為1.13，小于李除夕等建立的豆腐中庫(kù)特氏菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的偏差度和準(zhǔn)確度［15］，表明建立的模型有效且可靠，在已知初始菌數(shù)(N0)的情況下，可以快速預(yù)測(cè)5～35℃條件下不同貯藏時(shí)間點(diǎn)時(shí)單增李斯特菌在牛奶中的生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)論

比較了5、15、25和35℃條件下Gompertz方程、Logistic方程和Hill方程對(duì)單增李斯特菌在牛奶中生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線的擬合情況，確定Gompertz方程為最優(yōu)的初級(jí)模型。在此基礎(chǔ)上，采用Belehradek方程建立了相應(yīng)的二級(jí)模型。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:20℃條件下單增李斯特菌細(xì)菌總數(shù)的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值的殘差均小于0.2，模型的偏差度為1.04，準(zhǔn)確度為1.13，這表明建立的模型有效且可靠。在已知初始菌數(shù)的情況下，可以根據(jù)模型快速預(yù)測(cè)5～35℃條件下不同貯藏時(shí)間點(diǎn)時(shí)單增李斯特菌在牛奶中的生長(zhǎng)情況。本研究結(jié)果對(duì)預(yù)測(cè)和監(jiān)控食源性致病菌在食物中的生長(zhǎng)和繁殖，保證食品的安全性等方面具有參考價(jià)值。

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