于艷艷，丁 甜，劉東紅

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

嗜冷菌是指在7℃及以下可生長的微生物［1］，其種類繁多，在原料乳中最常見的嗜冷菌是革蘭氏陰性的假單胞菌屬(Pseudomonas)和革蘭氏陽性的桿菌屬(Bacillus)。嗜冷菌對原料乳品質(zhì)和貨架期有很大影響，擠奶設(shè)備的不徹底清洗和消毒被認為是引起嗜冷菌污染的主要原因之一［2］。雖然嗜冷菌在巴氏殺菌和UHT滅菌階段能夠被完全殺死，但是其在生長繁殖過程中產(chǎn)生了熱穩(wěn)定性的蛋白酶和脂肪酶，這些酶在熱處理之后仍能殘留一定活性，在乳制品儲藏過程中不斷分解蛋白質(zhì)和脂肪，最終導(dǎo)致乳制品出現(xiàn)苦味、腐爛味等風(fēng)味異常［3］。此外，某些嗜冷菌屬能夠產(chǎn)生毒素或者具有抗藥性而被認為是機會致病菌［4］。因此，嗜冷菌污染是影響乳品工業(yè)發(fā)展的重要因素，快速準確地檢測原料乳中嗜冷菌含量對提高乳制品品質(zhì)，加強企業(yè)經(jīng)濟效益有戰(zhàn)略意義。

國際標準中嗜冷菌的測定方法是將原料乳在6.5℃下培養(yǎng)10d計數(shù)，該方法能夠準確計數(shù)但是耗時過長。隨著微生物技術(shù)的不斷發(fā)展，化學(xué)方法、免疫技術(shù)、分子基因技術(shù)、物理方法等技術(shù)被應(yīng)用到微生物的快速檢測中，其中大都適用于乳制品微生物的檢測。這些新興技術(shù)的出現(xiàn)大大縮短了檢測時間，為乳制品企業(yè)及時有效地了解乳中嗜冷菌含量提供了依據(jù)。

1 嗜冷菌快速檢測方法

國內(nèi)外對嗜冷菌的快速檢測建立了許多方法(見表1)，這些方法不斷被優(yōu)化改進以求達到工業(yè)化應(yīng)用的目的。然而剛采集的新鮮原料乳中初始嗜冷菌占細菌總數(shù)的10%～50%，在低溫冷藏過程中再逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位［5］。一些快速檢測方法(如氨肽酶法、電阻抗法、ELISA、QCM等)檢測閾值較高，菌數(shù)達到104cfu/mL以上才能被檢出，不能第一時間得到新鮮生乳中的嗜冷菌含量。DEFT法近些年來少有報道，且在103cfu/mL以上才有較好線性關(guān)系。而脂肪酶活法受到乳中游離脂肪酸等因素影響，與嗜冷菌的相關(guān)性仍有待研究。

因此，本文將重點介紹其中幾種近些年來發(fā)展較快，低檢測閾值且快速省時的嗜冷菌檢測技術(shù)。

1.1 實時定量PCR

實時定量 PCR(Real－timeQuantitative Polymerase Chain Reaction，RQ－PCR)是在常規(guī) PCR體系中加入熒光染料或熒光探針，實現(xiàn)對PCR反應(yīng)過程的實時監(jiān)測和累加熒光信號的同步分析，從而克服了傳統(tǒng)PCR只能基于凝膠電泳定性判斷的缺點。很多研究表明該方法檢測限與平板計數(shù)法相近，例如對原料乳中類芽孢桿菌屬(Paenibacillus spp.)定量分析，其檢測限約為3.25 ×101cfu/mL［12］;而對污染奶樣中單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的 PCR 定量檢測限可達1.58 ×103cfu/mL［13］。

表1 主要幾種嗜冷菌快速檢測技術(shù)Table 1 Several major rapid detection methods of psychrophilic bacteria

目前RQ－PCR趨于更加節(jié)約時間和成本，在單一反應(yīng)中進行復(fù)合 PCR擴增成為研究趨勢［14］。Machado等人［15］針對不同目標基因設(shè)置了各自的特異性引物，對原料乳中不動桿菌屬(Acinetobacter)，熒光假單孢菌屬(P.fluorescens)，嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)和沙雷氏菌(Serratia)進行復(fù)合PCR探索分析，凝膠電泳結(jié)果可清晰區(qū)分4條不同長度的DNA鏈，表明在原料乳中同時檢測這四種細菌的可操作性。實時的復(fù)合PCR技術(shù)通常采用含有不同熒光素的特異性探針在擴增時進行同步監(jiān)測，而熒光染料不能特異性區(qū)分不同DNA片斷，需通過后續(xù)的融化曲線分析來克服此問題［16］。Omiccioli等人［17］比對了熒光探針復(fù)合PCR和融化曲線分析兩種方法來同時檢測奶樣中沙門氏菌(Salmomella spp.)、單增李斯特菌和大腸桿菌O157(Escherichia coli O157)，結(jié)果顯示雖然熒光探針復(fù)合PCR在檢測培養(yǎng)基樣品時更為靈敏，但兩種方法在對奶樣檢測時達到了同樣的檢測限:1cfu/125mL。這種技術(shù)的出現(xiàn)為原料乳中多種優(yōu)勢嗜冷菌屬的同步檢測奠定了基礎(chǔ)，比對單一菌屬的測定來反映嗜冷菌總數(shù)更具準確性。

但是RQ－PCR無法區(qū)分樣品中的DNA是來自活細胞還是死細胞。目前的解決方式是在DNA提取和擴增前先加入一種染料［18］，在該技術(shù)中染料EMA或PMA只能進入死細胞破壞其細胞完整性和DNA結(jié)構(gòu)，從而抑制死細胞DNA的擴增。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop－mediated Isothermal Amplification，LAMP)是針對目的基因的六個區(qū)域設(shè)計四條特異性引物，利用一種具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘快速擴增靶序列［19］。與PCR技術(shù)相比，這種技術(shù)不需要專用的實驗設(shè)備，在簡單的加熱儀器中就能進行，并且由于四條引物必須與六個靶基因準確雜交才能開始DNA合成，因此該技術(shù)具有極高的特異性［20］，例如Wang［21］等采用LAMP技術(shù)對原料乳中單增李斯特菌的檢測，且在沒有增菌培養(yǎng)的情況下與標準方法的檢測一致性高達91.67%，經(jīng)過增菌處理后能達100%一致性。

研究表明，在DNA合成階段產(chǎn)生的焦磷酸鎂衍生物沉淀所引起的體系濁度變化與目標基因的擴增數(shù)呈線性關(guān)系［22］，因此可以通過監(jiān)控體系的濁度變化來間接推算樣品中目標基因的含量，從而實現(xiàn)對樣品中菌數(shù)的定量分析。Shan等［23］就使用實時濁度分析儀定量檢測了食品中單增李斯特菌的hlyA基因，得到濁度閾值和菌濃度對數(shù)值之間的線性相關(guān)性為0.991，其最低檢測限可達6cfu/管。此外，微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn)使LAMP技術(shù)的操作變得更為便捷省時。Tourlousse［24］使用這種技術(shù)成功檢測到了沙門氏菌、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)等4種菌屬的目的基因，并在體系中加入了熒光染料，通過熒光分析儀的實時監(jiān)控同樣達到了對菌數(shù)定量檢測的目的，該反應(yīng)能在20min內(nèi)檢測到每1μL中10～100個基因的濃度，這種微流控芯片結(jié)合實時熒光分析設(shè)備的低成本復(fù)合體系將來可能成為現(xiàn)場嗜冷菌快速檢測的重要方式之一。

當然，這種靈敏度高、反應(yīng)時間短的技術(shù)也存在一定缺點:由于LAMP是鏈置換合成，一般建議其擴增區(qū)域距離為120～180bp，超過500bp的長鏈靶序列則難以擴增。

1.3 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)(FluorescenceInSitu Hybridization，F(xiàn)ISH)是通過已知外源的熒光標記寡核苷酸作為探針，基于堿基互補原則，與待檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶序列專一性結(jié)合，通過檢測雜交位點的熒光信號來對特定核苷酸序列進行定性、定量和定位分析［25］。與前兩種技術(shù)不同的是，F(xiàn)ISH不需要核酸提取或擴增的過程，因而被認為是快速檢測食品中微生物的重要方法之一。牛奶中嗜冷菌屬檢測方面，Kitaguchi［26］等人使用 16s rRNA 的寡核苷酸探針結(jié)合CTC染料染色在6h內(nèi)檢測牛奶中假單胞菌屬，與實際菌數(shù)的相關(guān)性可達0.99，該方法采用熒光顯微鏡人工計數(shù)，較為耗時耗力，引入自動化的圖像分析儀器更有助于實驗的快速進行［27］。另一方面，肽核酸探針比寡核苷酸探針的雜交速度更快［26］，例如采用Lac663肽核酸探針檢測牛奶中乳酸桿菌(Lactobacillus spp.)時大約需要 3h［28］，具有更廣闊的應(yīng)用前景。

隨著 FISH的發(fā)展，多色熒光原位雜交技術(shù)(multicolor fluorescence in situ hybridization)逐漸被應(yīng)用到食品中不同菌屬的同步檢測中，這種技術(shù)可利用不同熒光素標記的DNA探針對不同靶DNA同時進行分析。Yamaguchi［29］等人使用該技術(shù)在7h內(nèi)完成了牛奶中腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和假單胞菌屬的選擇性分析，他們結(jié)合一種小菌落計數(shù)的方法，快速測定樣品中目標細菌，得到了與平板計數(shù)法幾乎一致的結(jié)果，其檢測閾值可達2×103cells/mL，這為利用FISH技術(shù)在牛奶中復(fù)合檢測多種嗜冷菌屬提供了思路。

FISH技術(shù)也存在一定的缺點，例如在染色體含量較低的情況下，熒光信號的減弱會導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此要通過某些標記如生物素等來增強熒光信號。此外，雜交探針的設(shè)計也十分關(guān)鍵，特異性不足會導(dǎo)致實驗出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

1.4 流式細胞術(shù)

流式細胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是以流式細胞儀為工具，將懸浮液中的待測細胞熒光染色后，被染色細胞受強激光照射，產(chǎn)生光信號，經(jīng)一系列光電分析器接收分析后轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)信號［30］。這種技術(shù)同樣不需要DNA的提取和擴增過程，且具有快速、靈敏、分析量大等優(yōu)點，在乳制品微生物的快速檢測中有著良好的應(yīng)用。研究表明這種技術(shù)與傳統(tǒng)平板法之間具有較好的相關(guān)性:Cassoli［31］等對原料奶中細菌總數(shù)的研究結(jié)果顯示奶樣低溫儲藏24、48和72h后兩種方法的相關(guān)性分別大于0.82、0.87和0.91，并且不同時段采集的奶樣對結(jié)果沒有影響。與此同時，在奶制品中特定菌屬的檢測中，F(xiàn)lint［32］使用BactiFlow流式細胞儀檢測了奶粉中嗜熱菌的含量，樣品經(jīng)去除干擾因子，55℃保溫等處理后檢測結(jié)果和與平板培養(yǎng)法的相關(guān)系數(shù)可高達0.9748，可見兩種方法得到的結(jié)果已十分相近，其最低檢測限為103cfu/g。

此外，將流式細胞技術(shù)與其他一些高新技術(shù)結(jié)合也可得到很好的效果。Yamaguchi［33］等采用了一種微流體裝置——芯片流體分析并結(jié)合原位雜交技術(shù)來特異性檢測牛奶中假單胞菌屬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法能檢測到少于10cfu/mL的菌濃度，靈敏度高于平板培養(yǎng)。該方法需要約12h的增菌培養(yǎng)過程，總檢測時間大約16h。Ikeda［34］等采用類似的方法測定牛奶中的李斯特菌數(shù)，其檢出限為102cfu/mL，檢測時間僅為5h。

FCM檢測也受到多種因素的影響。由于乳中蛋白質(zhì)、脂肪球等大顆粒物質(zhì)的存在，會干擾流式細胞儀對目標細胞的定位，因此在乳品分析時首先將這些物質(zhì)清除。此外，熒光染料的選擇、細菌種類、細胞著色過程等也對其精度有一定影響。

1.5 ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光技術(shù)(Adenosine Triphosphate Bioluminescence)是將熒光素和微生物體內(nèi)ATP在熒光素酶E和Mg2+的作用下形成復(fù)合體，該復(fù)合體被分子氧氧化發(fā)生電激發(fā)，最后發(fā)射光［35］。由于一定生理時期的微生物體內(nèi)ATP的含量是相對穩(wěn)定的，而光信號與ATP量成正比，通過測定光信號就能得到ATP含量。這種方法能在幾分鐘內(nèi)完成檢測，且靈敏度高，重復(fù)性好，可作為食品工業(yè)中一般危害分析和 HACCP 的一部分［36］。

初始采用ATP生物發(fā)光法對原料乳中細菌數(shù)檢測時與標準平板法的相關(guān)性較低，這是由于乳中一些非微生物ATP(體細胞ATP、酪蛋白膠束上的游離ATP)的存在會干擾ATP檢測的精度，一些學(xué)者就通過一些前處理手段破壞這些非微生物ATP。李春艷［37］等在反應(yīng)體系中添加了體細胞裂解液，該方法與平板培養(yǎng)法之間的相關(guān)系數(shù)提高到0.9485。Wu［38］則通過二次離心和三磷酸腺苷雙磷酸酶預(yù)處理來降低液態(tài)益生菌產(chǎn)品中其他物質(zhì)的干擾，實驗結(jié)果表明，當去除了這些干擾因子，ATP生物發(fā)光法與平板培養(yǎng)法之間沒有顯著差別，該方法能在30min內(nèi)完成檢測，其最低檢測限為103cfu/mL。

目前一些研究趨于將ATP生物發(fā)光技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合以達到特異性檢測某些菌屬的目的。例如Cheng等［39］用生物磁性納米微粒(BMNPs)與ATP生物發(fā)光技術(shù)結(jié)合快速檢測巴氏殺菌乳中大腸桿菌含量。BMNPs的作用在于特異性結(jié)合到大腸桿菌表面使之輕易從樣品中分離。該方法能在1h內(nèi)完成檢測，其檢測限為20cfu/mL。這種快捷且具有特異性的方式為ATP生物發(fā)光技術(shù)特應(yīng)用到特異性檢測乳中優(yōu)勢嗜冷菌中指明了新的方向。

2 展望

嗜冷菌的快速檢測技術(shù)為乳制品企業(yè)及時了解原料乳中嗜冷菌污染情況提供了有力幫助，這些反應(yīng)靈敏、能檢測到低濃度菌含量的高新技術(shù)更是拓寬了檢測信息的廣度。實時定量PCR、LAMP、FISH等技術(shù)雖然只能檢測一種或幾種菌群，但對優(yōu)勢菌群的定量分析能快速判斷嗜冷菌的污染情況。流式細胞術(shù)能同時實現(xiàn)多個樣的處理，滿足現(xiàn)場大量樣品的檢測需求。ATP生物發(fā)光法是一種即時反應(yīng)技術(shù)，能迅速得到結(jié)果。然而這些技術(shù)大都成本較高，且在提取目標物、設(shè)計引物等技術(shù)上比較繁復(fù)，在投入工業(yè)化使用的過程中存在一定的局限性，還需要在技術(shù)及設(shè)備上加強改進。

當前我國乳品安全是社會公眾關(guān)注的熱點話題，確保原料的安全衛(wèi)生是乳制品企業(yè)收獲更好的經(jīng)濟效益的關(guān)鍵之一，這為原料乳快速檢測技術(shù)的發(fā)展提供了良好的契機。然而一些方法能在實驗室得到很好的結(jié)果但未必適合工業(yè)化的應(yīng)用，一種好的嗜冷菌檢測技術(shù)應(yīng)當具備靈快速、靈敏度高且成本低廉等優(yōu)點，能在工廠環(huán)境下實現(xiàn)現(xiàn)場快速準確的檢測，這就需要在成熟的技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)相應(yīng)操作簡便的檢測設(shè)備，類似微流控芯片的出現(xiàn)。隨著現(xiàn)代技術(shù)的不斷發(fā)展以及對工業(yè)化技術(shù)應(yīng)用的不斷改進，原料乳中嗜冷菌的快速檢測技術(shù)也能進一步朝著這樣的方向發(fā)展。

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