馬 蕾，郝紅偉，李慧玲，劉 敏，趙 文

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)中心，河北保定071000)

薔薇紅景天(Rhodiola rosea L.)，是景天科紅景天屬植物。我國野生資源豐富，儲藏量位居世界之首［1］。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天具有增強機體免疫功能、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、減輕高原反應(yīng)等多種功能［2－3］。衛(wèi)生部于1991年批準其為食品新資源。有關(guān)薔薇紅景天活性成分的研究，主要是紅景天苷和酪醇，對原花青素的研究較少。Gad G.Yousef等研究表明不同品種薔薇紅景天含有的原花青素聚合度不同［4］;A.Panossian等證實，薔薇紅景天富含以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為基本結(jié)構(gòu)單元的原花青素［5］。趙文、孟玉彩［6－7］等研究表明，河北省張家口產(chǎn)薔薇紅景天富含原花青素，其含量為3.6%，是以EGCG/EGC為基本結(jié)構(gòu)單元組成的原翠雀定類原花色素。但未見有關(guān)薔薇紅景天原花青素對抗脂質(zhì)過氧化等抗氧化效應(yīng)的研究報道。

有研究表明，自由基連鎖反應(yīng)引起的脂質(zhì)過氧化會導(dǎo)致細胞損傷、衰老或死亡，與人體許多疾病及衰老密切相關(guān)［8－9］。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)能特異地、有效地清除自由基，從而有效地阻止脂質(zhì)過氧化。隨機體的衰老，SOD和GSH－Px活性逐漸降低，體內(nèi)自由基得不到及時清除，導(dǎo)致自由基作用于生物膜脂質(zhì)雙分子層中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化，形成丙二醛(MDA)等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物［10］。MDA能使蛋白質(zhì)、核酸、脂類發(fā)生交聯(lián)，使生物膜變性、細胞突變、衰老或死亡［11］。此外，許多研究表明，MDA的生成量反映體內(nèi)細胞受自由基氧化的程度，在衰老過程中起重要作用［12］。單胺氧化酶(MAO)是線粒體外膜上參與胺類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶類，主要分布在大腦皮層、海馬區(qū)、下丘腦以及肝臟、心臟等組織中，動物外周組織中該酶和腦組織中該酶亞型的水平與過氧化損傷程度正相關(guān)［13］。

對小鼠長期注射D－半乳糖是建立小鼠過氧化損傷模型的經(jīng)典方法［14］。機體內(nèi)D－gal濃度增高，產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)與羥自由基(·OH)等自由基，會使體內(nèi)的SOD、GSH－Px等抗氧化物水平降低，進一步加重自由基累積，進而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，破壞ATP合成，啟動自由基級聯(lián)效應(yīng)。因此，本實驗以D－gal所致過氧化損傷模型小鼠作為實驗對象，以模型小鼠的血清及心臟、肝臟、腦組織中的SOD、GSH－Px、MDA、MAO為觀察指標，探討了OPCRR對D－gal誘導(dǎo)機體過氧化損傷的保護作用，為開發(fā)新型保健食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

薔薇紅景天低聚原花青素 制作工藝參考專利方法［15］;SPF 級 ICR 小鼠 雌性，18～22g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號:SCXK(京)2009－0004;D半乳糖 Sigma公司;抗壞血酸分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠;T－SOD、MDA、GSH－Px、MAO、總蛋白等試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Scientz－ⅡD超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;TDL－5離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;SK－1快速混勻器 江蘇金檀醫(yī)療儀器廠;1500－823酶標儀 Thermo Scientific公司;96孔細胞培養(yǎng)板 Corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 OPCRR的制備 乙酸乙酯萃取與AB－8大孔吸附樹脂吸附相結(jié)合制備薔薇紅景天原花青素。乙酸乙酯萃取25min、體積比(乙酸乙酯∶提取液)1.5∶1、萃取次數(shù)4次;AB－8大孔吸附樹脂的最佳上樣液pH為4.5，解析液pH為5，徑高比為1∶40(cm)。由此分離純化得到OPCRR的純度為88.3%。

1.2.2 劑量設(shè)計與動物處理 動物購入后，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后測量體重開始實驗。將小鼠隨機分為6組，依次為溶劑對照組、模型對照組、陽性對照組和OPCRR低、中、高劑量組，每組10只。除溶劑對照組外，其余5組采用D－半乳糖皮下注射法制備小鼠亞急性過氧化損傷模型，即每天定時頸背部皮下多點注射100mg/kg·bw的D－半乳糖，溶劑對照組以注射用生理鹽水代替，連續(xù)49d。

在造模的同時，各劑量組動物灌胃給予OPCRR，三個劑量分別為80、160和320mg/kg·bw，陽性對照組給予維生素C 100mg/kg·bw，溶劑對照組和模型對照組給予蒸餾水。

1.2.3 樣本采集與制備 實驗(造模和給予受試物)第49d，每組隨即選取十只小鼠，稱量體重，摘眼球取血，制備血清。解剖小鼠取其肝、心和腦組織，稱量臟器重量后所有樣品儲存于－80℃冰箱中待用。

指標檢測前，按照試劑盒說明書及預(yù)實驗確定實驗條件和取樣量。分裝后的小鼠血清兩份保留原液，一份用生理鹽水按1∶3稀釋為25%血清。小鼠的心、腦、肝組織加入9倍體積生理鹽水后，在冰浴條件下采用超聲細胞破碎儀破碎成勻漿。隨后3000r/min離心10min，取上清液即為用于指標檢測的10%組織勻漿。用生理鹽水將10%組織勻漿按比例稀釋為5%，1%和0.25%組織勻漿用于相關(guān)生化指標的檢測。

1.2.4 生化指標測定 采用全自動生化分析儀依據(jù)試劑 盒 說 明 書 測 定 SOD［16］、GSH － Px［17］、MDA［18］、MAO［19］含量，蛋白定量按試劑盒說明用 BCA 法［20］測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，整體分析采用單因素方差分析法(One－way ANOVA)，進一步組間比較分別采用Duncan氏多重分析法和LSD氏多重分析法。

2 結(jié)果與分析

2.1 OPCRR對小鼠體征、體重和臟器系數(shù)的影響

實驗過程中，日常體征行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):在實驗初期的適應(yīng)性飼養(yǎng)階段，各組小鼠皮毛濃密有光澤，精神振奮，進食量大，反抗力強，難以抓取;隨著實驗的進行，除溶劑對照組變化較為緩慢外，其余各組均出現(xiàn)不同程度的過氧化損傷表征，以模型組最為明顯，陽性對照組的小鼠則相對行動敏捷;至實驗?zāi)┢?，溶劑對照組小鼠雖不如初期靈活和毛色光亮，但無明顯脫毛和虛弱現(xiàn)象，而模型對照組則出現(xiàn)皮毛稀疏且少量脫毛的現(xiàn)象，反應(yīng)遲緩，活動量銳減，四肢無力，抓取時反抗微弱，陽性對照組和各OPCRR劑量組介于兩者之間。

小鼠的平均體重增長及心、肝、腦系數(shù)見表1。盡管數(shù)據(jù)軟件分析發(fā)現(xiàn)各組間的體重增長存在不同程度差異，但無特定分布規(guī)律;溶劑對照組的臟器系數(shù)介于各組之間，雖有差別，但除去腦系數(shù)的高劑量組和心系數(shù)的中高劑量組外，各組之間比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(p＞0.05);模型對照組的臟器系數(shù)與溶劑對照無顯著性差異。由此認為上述組間差異是由個體差別及環(huán)境等非實驗因素造成，本文不再深入分析。

表1 小鼠體重增長和臟器系數(shù)±s)Table 1Body weight increase and apparatus coefficient of mice±s)

表1 小鼠體重增長和臟器系數(shù)±s)Table 1Body weight increase and apparatus coefficient of mice±s)

注:同列數(shù)值后的不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著性差異。

組別 劑量(mg/kg·bw) 體重增長(g)心系數(shù)(mg/g)肝系數(shù)(mg/g)腦系數(shù)(mg/g)溶劑對照 0 7.3±2.3a 4.99±0.2a 45.3±3.4a 14.2±2.1a模型對照 0 6.0±1.9ab 4.79±0.4ab 43.7±3.3a 14.0±1.3ab陽性對照 100 5.5±1.4bc 4.90±0.4ab 46.9±4.7a 13.1±1.6ab低劑量 80 8.3±1.1bc 4.89±0.7ab 45.2±3.5a 14.8±1.4ab中劑量 160 8.1±1.2c 4.34±0.3b 45.5±5.0a 14.3±2.7ab高劑量 320 7.0±1.8c 4.71±0.9b 41.1±11.0a 14.7±1.8b

表2 OPCRR對過氧化損傷小鼠SOD水平的影響(s)Table 2 OPCRR’s effects on SOD lever of per－oxidative damage mices)

表2 OPCRR對過氧化損傷小鼠SOD水平的影響(s)Table 2 OPCRR’s effects on SOD lever of per－oxidative damage mices)

注:*表示與模型組存在的顯著性差異，＊＊表示極顯著性差異，表3～表5同。

組別 劑量(mg/kg·bw)只數(shù)(n)血清SOD活力(U/mgprot)心臟SOD活力(U/mgprot)肝臟SOD活力(U/mgprot)腦組織SOD活力(U/mgprot)溶劑對照 0 10 66.0±3.3* 55.6±2.1* 37.8±2.2* 96.2±3.2*模型對照 0 10 58.7±2.3 67.6±1.6 32.6±0.9 81.3±4.2陽性對照 100 10 68.3±6.7* 88.1±12.6 48.9±5.3* 133.6±34.4＊＊低劑量 80 10 76.8±19.0＊＊ 68.2±5.6 41.6±9.1 115.5±11.3＊＊中劑量 160 10 72.7±5.9＊＊ 73.1±5.0 44.8±2.0* 130.1±29.4＊＊高劑量 320 10 75.8±11.0＊＊ 86.6±9.2＊＊ 52.9±13.8＊＊ 148.6±26.5＊＊

表3 OPCRR對過氧化損傷小鼠GSH－Px水平的影響s)Table 3 OPCRR’s effects on GSH－Px lever of per－oxidative damage mices)

表3 OPCRR對過氧化損傷小鼠GSH－Px水平的影響s)Table 3 OPCRR’s effects on GSH－Px lever of per－oxidative damage mices)

組別 劑量(mg/kg·bw)只數(shù)(n)血清GSH－Px活力(U/mgprot)心臟GSH－Px活力(U/mgprot)肝臟GSH－Px活力(U/mgprot)腦組織GSH－Px活力(U/mgprot)溶劑對照 0 10 0.91±0.09* 193±37* 1.13±0.26＊＊ 204±80*模型對照 0 10 0.70±0.16 140±10 0.86±0.07 147±57陽性對照 100 10 1.02±0.51* 210±11* 0.72±0.11* 233±72低劑量 80 10 0.87±0.22 163±36 1.01±0.59* 224±69中劑量 160 10 1.10±0.40* 184±29 1.04±0.74＊＊ 276±67*高劑量 320 10 1.18±0.34＊＊ 188±64* 1.14±0.12＊＊ 307±185＊＊

2.2 對過氧化損傷小鼠SOD水平的影響

表2表示OPCRR對小鼠血清及臟器中SOD活力的影響。模型對照組與溶劑對照均差異顯著(p＜0.05)，說明本模型條件下血清及各臟器組織在SOD活力水平方面體現(xiàn)了過氧化損傷特征。與模型對照組相比，陽性對照組、OPCRR各劑量組均能升高血清SOD活力水平，其中OPCRR低中高三個劑量組均差異極顯著(p＜0.01);與模型對照組相比，OPCRR低、中劑量組有升高心臟SOD活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR高劑量組能極顯著升高心臟SOD活力水平(p＜0.01);與模型對照組相比，OPCRR低劑量組有升高肝臟SOD活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR中劑量組能顯著升高肝臟SOD活力水平(p＜0.05)，OPCRR高劑量組能極顯著升高肝臟SOD活力水平(p＜0.01);與模型對照組相比，陽性對照組、OPCRR各劑量組均能升高腦組織SOD活力水平，且均差異極顯著性(p＜0.01)。

2.3 對過氧化損傷小鼠GSH－Px水平的影響

表3表示OPCRR對小鼠血清及臟器中GSH－Px活力的影響。模型對照組與溶劑對照均差異顯著(p＜0.05)，說明本模型條件下血清及各臟器組織在GSH－Px活力水平方面體現(xiàn)了過氧化損傷特征。與模型對照組相比，OPCRR低劑量組有升高血清GSH－Px活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR中劑量組能顯著升高血清GSH－Px活力水平(p＜0.05)，OPCRR高劑量組能極顯著升高血清GSH－Px活力水平(p＜0.01);與模型對照組相比，OPCRR低中劑量組有升高心臟GSH－Px活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR高劑量組能顯著升高心臟GSH－Px活力水平(p＜0.05);與模型對照組相比，OPCRR低劑量組有顯著升高肝臟GSH－Px活力水平的趨勢(p＜0.05)，OPCRR中高劑量組能極顯著升高肝臟 GSH－Px活力水平(p＜0.01);與模型對照組相比，OPCRR低劑量組有升高腦組織GSH－Px活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR中劑量組能顯著升高腦組織GSH－Px活力水平(p＜0.05)，OPCRR高劑量組能極顯著升高腦組織GSH－Px活力水平(p＜0.01)。

表4 OPCRR對過氧化損傷小鼠MDA水平的影響s)Table 4 OPCRR’s effects on MDA lever of per－oxidative damage mice(s)

表4 OPCRR對過氧化損傷小鼠MDA水平的影響s)Table 4 OPCRR’s effects on MDA lever of per－oxidative damage mice(s)

組別 劑量(mg/kg·bw)只數(shù)(n)血清MDA活力(U/mgprot)心臟MDA活力(U/mgprot)肝臟MDA活力(U/mgprot)腦組織MDA活力(U/mgprot)溶劑對照 0 10 29.1±2.4* 14.5±0.9* 5.0±0.6* 12.8±1.8*模型對照 0 10 32.1±2.2 15.3±0.5 6.1±2.1 15.3±1.6陽性對照 100 10 22.1±4.0＊＊ 13.1±0.7 5.2±1.2 11.4±2.0低劑量 80 10 27.4±4.2＊＊ 15.1±1.8 4.4±0.6＊＊ 12.6±3.8中劑量 160 10 26.0±2.1＊＊ 14.0±2.6 4.3±0，8＊＊ 12.2±2.4高劑量 320 10 25.2±1.6＊＊ 10.3±1.5* 4.0±0.7＊＊ 10.1±2.0*

2.4 對過氧化損傷小鼠MDA水平的影響

表4表示OPCRR對小鼠血清及臟器中MDA含量的影響。模型對照組與溶劑對照均差異顯著(p＜0.05)，說明本模型條件下血清及各臟器組織在MDA含量方面體現(xiàn)了過氧化損傷特征。與模型對照組相比，陽性對照組、OPCRR各劑量組均能降低血清MDA含量且均差異極顯著(p＜0.01);與模型對照組相比，OPCRR低中劑量組有降低心臟MDA含量的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR高劑量組能顯著降低心臟MDA含量(p＜0.05);與模型對照組相比，OPCRR各劑量組均能降低肝臟MDA含量且均差異極顯著性(p＜0.01);OPCRR低中劑量組有降低心臟MDA含量的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR高劑量組能顯著降低心臟MDA含量(p＜0.05)。

2.5 對過氧化損傷小鼠MAO水平的影響

表5表示OPCRR對小鼠腦組織和肝臟中MAO活力的影響。模型對照組與溶劑對照均差異顯著(p＜0.05)，說明本模型條件下肝臟及腦組織在MAO含量方面體現(xiàn)了過氧化損傷特征。與模型對照組相比，OPCRR低劑量組有降低腦組織MAO活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR中高劑量組能極顯著降低腦組織MAO活力水平(p＜0.01);與模型對照組相比，OPCRR低中劑量組有降低肝臟MAO活力水平的趨勢，但是無顯著性差異(p＞0.05)，OPCRR高劑量組能顯著降低肝臟MAO活力水平(p＜0.05)。

表5 OPCRR對過氧化損傷小鼠MAO水平的影響(s)Table 5 OPCRR’s effects on MAO lever of per－oxidative damage mice(s)

表5 OPCRR對過氧化損傷小鼠MAO水平的影響(s)Table 5 OPCRR’s effects on MAO lever of per－oxidative damage mice(s)

組別 劑量(mg/kg·bw)只數(shù)(n)腦組織MAO活力(U/mgprot)肝臟MAO活力(U/mgprot)溶劑對照 0 10 0.81±0.14* 2.2±0.41*模型對照 0 10 0.98±0.22 2.4±0.65陽性對照 100 10 0.71±0.37* 2.0±0.52低劑量 80 10 0.77±0.23 2.1±0.60中劑量 160 10 0.65±0.14＊＊ 1.8±0.43高劑量 320 10 0.62±0.17＊＊ 1.7±0.72*

3 結(jié)論與討論

本實驗利用D－gal建立小鼠過氧化損傷模型，以小鼠血清和心、肝、腦組織的SOD、GSH－Px活性、MDA及肝、腦MAO活性為檢測指標，結(jié)果表明，與模型對照組相比，160～320mg/kg·bw OPCRR對主要臟器中SOD、GSH－Px活性的提高作用優(yōu)于陽性對照，降低MDA含量的能力優(yōu)于陽性對照，并不同程度降低腦組織和肝臟中MAO活力。

張明月等［21－22］研究表明，葡萄籽原花青素可提高小鼠全血SOD活力，降低MDA含量，并且提高臟器SOD、GSH－Px等抗氧化酶的活力，顯示出其具有極強的抗過氧化損傷能力。張澤生等［23］發(fā)現(xiàn)50mg/kg·bw葡萄籽提取物可顯著提高D－gal致氧化損傷小鼠血清SOD活性。Bagchi等［24］研究表明補充葡萄籽提取物可以改善心肌功能，減少MDA生成。葡萄籽提取物也可以保護小鼠由阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷［25］。本研究表明OPCRR在320mg/kg·bw的劑量下，可有效防止D－gal導(dǎo)致的小鼠心臟SOD的活性下降，使其活性提高28.1%。證明OPC對動物的心肌有保護作用，補充OPCRR可以改善心肌功能。Bagchi等［25］發(fā)現(xiàn)在100mg/kg·bw劑量下葡萄籽提取物OPC、VC、VE和β－胡蘿卜素均可降低TPA(12－O－four sunflower acyl Buddha alcohol－13－acetate)誘導(dǎo)腹腔巨噬細胞產(chǎn)生的活性氧，且葡萄籽提取物OPC的作用優(yōu)于其他抗氧化劑。張波等［26］發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物OPC在劑量為100mg/kg·bw時，可減少乙醇性肝損傷小鼠肝組織中MDA含量，SOD含量明顯上升。張琳等［27］研究表明缺血再灌注會導(dǎo)致肝臟氧自由基清除不足并引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，而300mg/kg·bw OPC預(yù)處理則可通過增強細胞的SOD活性，而減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。本研究證明OPCRR在80mg/kg·bw時，可明顯增加小鼠肝組織GSH－Px活力，提高7.9%，并使MDA含量下降31.8%。說明OPCRR與葡萄籽OPC比較，在較低劑量下即具有保護肝臟對抗脂質(zhì)過氧化的能力。劉玉梅等［28］考察葡萄籽原花青素(GSP)對小鼠腦組織過氧化損傷的保護作用。結(jié)果證明，96%的 GSP在劑量為20mg/kg·bw時，可抑制由D－gal所致的小鼠腦組織SOD、GSH－Px活力的下降，以及MDA含量的升高。本研究證明OPCRR在320mg/kg·bw時，可顯著增加小鼠腦組織GSH－Px活力，提高50.3%，并使MDA含量下降了33.7%。此外，Koga等一次性給予禁食大鼠GSP 25mg/kg·bw，研究其對大鼠血漿抗氧化水平的影響［29］，表明口服GSP可增加大鼠抗氧化能力。本研究發(fā)現(xiàn)，OPCRR在80mg/kg·bw時，可顯著增加小鼠血清SOD活力，提高31.6%，在160mg/kg·bw時，顯著提高血清GSH－Px活力，提高65.5%，MDA含量下降了19.1%。

綜上，薔薇紅景天低聚原花青素有很好的抗氧化活性，通過增強機體清除氧自由基的能力，減少體內(nèi)自由基產(chǎn)生，進而保護細胞免受過氧化損傷。與模型對照組相比，OPCRR實驗組能提高血清及臟器中SOD、與GSH－Px活力，并降低MDA含量與MAO活力，由此可見，OPCRR可以從多個角度減輕小鼠的過氧化損傷狀態(tài)，其機制與過氧化損傷老齡動物的抗氧化水平有關(guān)，而最佳作用條件還有待進一步探索。

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