萬星驛，高麗輝，馮國華，張 媛，劉 旭，李 玲

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南昆明 650500；2.湖南省兒童醫(yī)院，湖南長沙 410007）

胰島素抵抗是機(jī)體對(duì)胰島素的生物學(xué)效應(yīng)降低的一種狀態(tài)，即在胰島素的刺激下細(xì)胞攝取利用葡萄糖的能力降低。脂肪組織作為胰島素作用的外周靶組織之一，在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取依賴于細(xì)胞膜上分布的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporter 4，GLUT4），在胰島素的刺激下能將細(xì)胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，而胰島素信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)異常將導(dǎo)致胰島素抵抗。蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB／Akt）是胰島素信號(hào)通路的關(guān)鍵激酶，而脂聯(lián)素（adiponectin）則是脂肪細(xì)胞分泌的激素，它們均與胰島素抵抗相關(guān)。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）化學(xué)結(jié)構(gòu)為 3，5，7，3′，4′，5′-六羥基-2，3雙氫黃酮醇，是一種重要的黃酮類化合物，廣泛存在于楊梅科、葡萄科、杜鵑科、大戟科等植物中，具有抗氧化、抗菌消炎、抑制腫瘤、保護(hù)肝臟、抗高血壓、調(diào)節(jié)血糖血脂［1］等藥理作用。

據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，天貓2017年11月11日當(dāng)天成交額1682億元、無線成交占比90%、全天支付總筆數(shù)達(dá)到14.8億、全天物流訂單達(dá)8.12億、交易覆蓋全球225個(gè)國家和地區(qū)……在這一系列瘋狂的數(shù)據(jù)背后，毫無疑問，阿里巴巴推動(dòng)下的“天貓雙11”已經(jīng)成為全球規(guī)模最大的購物狂歡節(jié)。從曾經(jīng)網(wǎng)購興起時(shí)的5200萬到如今全球性的消費(fèi)熱潮，“雙11”映照著社會(huì)運(yùn)行機(jī)制的“晴雨表”，也標(biāo)示著治理體系和治理能力現(xiàn)代化的水平。

前期研究表明，DMY能明顯降低四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血糖水平和改善糖耐量［2］。陳靜等［3］研究也發(fā)現(xiàn)，DMY能改善D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠糖耐量異常狀態(tài)，降低胰島素抵抗。體外實(shí)驗(yàn)表明［4］，DMY能增加高糖高胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗L6肌管細(xì)胞的葡萄糖攝取量，改善其胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。然而DMY對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的影響和機(jī)制尚未見報(bào)道。因此，本研究擬采用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞形成胰島素抵抗，探討DMY對(duì)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用，并以Akt、GLUT4、脂聯(lián)素為靶點(diǎn)初步探討作用機(jī)制，為DMY的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

O’Malley&Chamot(1990)將學(xué)習(xí)策略分為三類，一是是元認(rèn)知策略、二是認(rèn)知策略、三是社會(huì)/情感策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 3T3-L1前脂肪細(xì)胞購于ATCC（A-merican Type Culture Collection）。

2.3 DMY對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞GLUT4、Akt2和脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響

1.1.2 試劑 DMY購自寧波德康生物制品有限公司，純度＞90% （HPLC）。H-DMEM和新生牛血清（NBCS）購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自 Hyclone公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 （IBMX）、地塞米松、胰島素均購自Sigma公司；羅格列酮購自北京高博醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)開發(fā)有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒購自天根公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq DNA聚合酶均購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；百級(jí)層流超凈臺(tái)（珠海市再鑫儀器有限公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；全波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-RAD公司）

結(jié)果顯示，胰島素刺激下，地塞米松模型組GLUT4的基因表達(dá)量較正常組明顯下降（P＜0.05）；加入1×10－8mol·L－1的 DMY和 1×10－6mol·L－1的羅格列酮作用后，胰島素抵抗脂肪細(xì)胞GLUT4基因的表達(dá)量較地塞米松組明顯增加（P＜0.01，F(xiàn)ig 3），提示DMY能促進(jìn)脂肪細(xì)胞表達(dá)GLUT4基因。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞以1×107cells·L－1的密度接種于96孔板，用含10%NBCS的H-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待細(xì)胞生長融合至接觸抑制后2天，參照文獻(xiàn)［5］加入含 0.5 mmol·L－1IBMX、1μmol·L－1地塞米松、1 mg·L－1胰島素和 1μmol·L－1羅格列酮的H-DMEM培養(yǎng)基 （含10%FBS）培養(yǎng)2 d，再換為含1 mg·L－1胰島素的10%FBS H-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，之后更換為10%FBS H-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天換液1次，直至細(xì)胞完全分化成脂。

1.2.2 DMY對(duì)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的影響 參照文獻(xiàn)方法［6］取分化成脂的細(xì)胞設(shè)正常組、DMY 1×10－5、1×10－6、1×10－7、1×10－8mol·L－1濃度組和羅格列酮1×10－6mol·L－1組，作用48 h，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，并計(jì)算出葡萄糖的消耗量。每組3復(fù)孔，重復(fù)3次以上。

在1 nmol·L－1的胰島素刺激下，地塞米松模型組的葡萄糖消耗量較正常組減少18.4% （P＜0.01），表明其對(duì)胰島素的敏感性下降。DMY（1×10－6～1×10－8mol·L－1）濃度依賴性的增加胰島素抵抗脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量（Fig 2），與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，0.01），與羅格列酮相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示DMY能促進(jìn)胰島素的作用，改善脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

1.2.4 DMY對(duì)GLUT4、Akt2和脂聯(lián)素基因表達(dá)影響 ①總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：參照試劑盒說明書提取3T3-L1脂肪細(xì)胞的總RNA。定量后，依次 加入 Oligo（dT）18primer 1μl，RNase-Free ddH2O和RNA，置于 PCR擴(kuò)增 儀中65℃反應(yīng)5 min后取出，加入 5×Reaction Buffer 4μl，Ribolock RNase Inhibitor 1μl，10 mmol·L－1dNTP Mix 2μl，Revert Aid Reverse Transcriptase 1μl，充分混勻后，放入PCR擴(kuò)增儀中，42℃反應(yīng)60 min，70℃反應(yīng) 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物于－20℃保存?zhèn)溆谩＂?PCR反應(yīng)：冰上操作，加入 Taq酶 10μl，引物 2μl，cDNA 2～4 μl，RNase-Free ddH2O加至20μl。充分混勻后放入PCR擴(kuò)增儀。循環(huán)的條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，57.4（GLUT4）／55.3℃（Akt2）／54.7℃（脂聯(lián)素）退火 35 s，72℃延伸 45 s，32個(gè)循環(huán)72℃繼續(xù)延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆谩＂跴CR擴(kuò)增片段的凝膠電泳：先將擴(kuò)增產(chǎn)物與6×loading buffer（含2.5%核酸染料）以5∶1混合均勻，取其中6μl加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.015的瓊脂糖凝膠。GLUT4和Akt2擴(kuò)增片段于80 mV恒定電壓進(jìn)行電泳60 min。脂聯(lián)素?cái)U(kuò)增片段于80 mV恒定電壓進(jìn)行電泳65 min。電泳結(jié)果采用凝膠成像系統(tǒng)拍攝，通過 Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。GLUT4上游引物：5′-GCTTTGTGGCCTTCTTTGAG-3′；下游引物：5′-CGGCAAATAGAAGGAAGACG-3′；Akt2上游引物：5′-TCGGCAAGGTCATTCTGGT-3′；下游引物：5′-GGCATACTCCATCACAAAGCA-3′；脂聯(lián)素 上游引物：5′-GACGTTACTACAACTGAAGAGC-3′；下 游 引 物：5′-CATTCTTTTCCTGATACTGGTC-3′；內(nèi)參為 GAPDH 上游引物：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′；下游引物：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

海上絲綢之路是古代中國與世界其他區(qū)域進(jìn)行文化交流和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的海上通道。海上的歷史最早可追溯到西漢時(shí)期，以徐聞、合浦等港口為起點(diǎn)。宋元時(shí)期，中國的造船技術(shù)和航海技術(shù)有極大的提升，促進(jìn)了海上絲路貿(mào)易的發(fā)展。廣州是海上絲綢之路的重要港口，其獨(dú)特的地理位置，往來貿(mào)易日益繁華，在此背景下廣彩瓷器應(yīng)運(yùn)而生，成為“十八世紀(jì)歐洲的寵兒”。正因廣彩是絲綢之路的產(chǎn)物，貿(mào)易互通對(duì)廣彩的風(fēng)格樣式造成了巨大的影響，造就了廣彩金碧輝煌的視覺效果和歡快明亮的洛可可裝飾風(fēng)格，成就了獨(dú)特的廣彩藝術(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 DMY對(duì)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常3T3-L1脂肪細(xì)胞加入系列濃度的 DMY（1×10－5～1×10－8mol·L－1）作用48 h后，其葡萄糖消耗量與正常組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Tab 1）。

Tab 1 Effect of DMY on glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes±s，n＝3）

Tab 1 Effect of DMY on glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes±s，n＝3）

Group Concentration／mol·L－1 Glucose consumption／mmol·L－1 Control 5.06±0.11 DMY 1×10－5 4.94±0.36 1×10－6 4.95±0.13 1×10－7 4.87±0.18 1×10－8 5.07±0.11 Rosiglitazone 1×10－65.04±0.18

2.3.1 DMY對(duì)GLUT4基因表達(dá)的影響 RT-PCR

粘貼加固方法主要是在鋼板與混凝土表面之間加墊款，再采用環(huán)氧樹脂膠泥對(duì)周邊進(jìn)行有效的封閉，使混凝土與鋼板形成封閉的空腔，同時(shí)對(duì)每片鋼板最低點(diǎn)實(shí)施注膠，這在較大程度上有利于注膠內(nèi)空氣的排出。對(duì)鋼板采用粘貼加固方法時(shí)，首先對(duì)混凝土松散層進(jìn)行清理至平整為止，在此基礎(chǔ)上對(duì)鋼板粘接面采用工具清理干凈，再用專業(yè)的工具在鋼板中涂抹結(jié)構(gòu)膠，最后將鋼板粘貼到預(yù)定的位置，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行鉆孔固定。

Fig 1 Effect of DMY on basal glucose consumption in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes（±s，n＝3）△△P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs dexamethasone group.

1.2.3 3T3-L1細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立與藥物處理 參照文獻(xiàn)方法［6－8］，取誘導(dǎo)分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞分為正常對(duì)照組、地塞米松模型組、DMY系列濃度組（1×10－6～1×10－8mol·L－1）和陽性藥物羅格列酮1×10－6mol·L－1組。正常對(duì)照組用10%FBSH-DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，其余各組給予1×10－6mol·L－1地塞米松培養(yǎng)7 d誘導(dǎo)形成胰島素抵抗模型，地塞米松作用4 d后加入受試藥物DMY和羅格列酮，加入胰島素刺激或藥物單獨(dú)作用，72 h后采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量，并計(jì)算出葡萄糖的消耗量。每組3復(fù)孔，重復(fù)3次以上。此外，收集細(xì)胞提取RNA，凍存于 －80℃?zhèn)錅y(cè) GLUT4、Akt2和脂聯(lián)素基因。

Fig 2 Effect of DMY on insulin-stimulated glucose consumption in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes±s，n＝3）△△P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs dexamethasone group

取5份100 g的藕片，放入300 g水中，加入硬化劑的濃度為1.1%，分別在20，30，40，50，60 ℃的條件下硬化2 h，根據(jù)感官評(píng)價(jià)選擇合適的硬化溫度。

2.2 DMY對(duì)地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的改善作用 在無胰島素刺激的情況下，地塞米松模型組的葡萄糖消耗量較正常組明顯減少（P＜0.01），提示胰島素抵抗模型復(fù)制成功。而加入 5×10－7～1×10－8mol·L－1DMY和陽性藥物羅格列酮（1×10－6mol·L－1）作用72 h后，其葡萄糖消耗量較地塞米松模型組明顯增加（P＜0.01，F(xiàn)ig 1），提示DMY單獨(dú)作用能改善脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

實(shí)驗(yàn)使用的腦電數(shù)據(jù)集由德國波恩大學(xué)的癲癇研究實(shí)驗(yàn)室收集。該腦電數(shù)據(jù)集來自五名志愿者，包含兩名健康人和三名癲癇病患者，對(duì)應(yīng)的五個(gè)數(shù)據(jù)集分別標(biāo)記為Z，O，N，F(xiàn)，S。其中，腦電數(shù)據(jù)的采集位置如表1[7]所示，每個(gè)數(shù)據(jù)集包含100個(gè)信道，腦電信號(hào)的采樣頻率、持續(xù)時(shí)間和采樣點(diǎn)數(shù)分別為173.61Hz、23.6s和4097個(gè)。

Fig 3 Effect of DMY on GLUT4 mRNA expression in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes（±s，n＝3）△P＜0.05 vs control group；**P＜0.01 vs dexamethasone group.

2.3.2 DMY對(duì)Akt2基因表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示，在胰島素刺激下，地塞米松模型組Akt2基因的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯下降（P＜0.05），加入 DMY 1×10－8mol·L－1和1×10－6mol·L－1羅格列酮后，胰島素抵抗脂肪細(xì)胞Akt2基因的表達(dá)量明顯增加，與地塞米松模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 4），提示DMY能上調(diào)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞Akt2基因的表達(dá)。

2.3.3 DMY對(duì)脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地塞米松作用后，在胰島素刺激條件下，脂聯(lián)素基因表達(dá)量較正常組明顯下降（P＜0.05）。1×10－7和1×10－8mol·L－1DMY組和 1×10－6mol·L－1羅格列酮組均能明顯上調(diào)脂聯(lián)素基因表達(dá)量（P＜0.05），其中 DMY 1×10－8mol·L－1組的脂聯(lián)素基因表達(dá)量與正常組相比P＜0.05，與Dex組比較P＜0.01（Fig 5），提示DMY能促進(jìn)胰島素抵抗脂肪細(xì)胞脂聯(lián)素基因的表達(dá)。

除了試驗(yàn)示范的多個(gè)優(yōu)質(zhì)稻新品種，觀摩現(xiàn)場(chǎng)還展示了多種智能化農(nóng)機(jī)具——激光平地機(jī)作業(yè)精度達(dá)到正負(fù)兩厘米，一小時(shí)可以作業(yè)2～3畝；旋耕、施肥、播種一體機(jī)，可以控制播種深度，實(shí)現(xiàn)種肥精確控制，節(jié)本效果明顯；無人駕駛智能收割機(jī)，可以實(shí)現(xiàn)自主導(dǎo)航路徑規(guī)劃與作業(yè)，自動(dòng)行駛、收割、脫粒、卸糧。

Fig 4 Effect of DMY on Akt2 mRNA expression in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes（±s，n＝3）△△P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs dexamethasone group.

Fig 5 Effect of DMY on adiponectin mRNA expression in insulin resistant 3T3-L1 adipocytesˉx±s，n＝3）△P＜0.05 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs dexamethasone group.

3 討論

胰島素抵抗是指肌肉、肝臟和脂肪細(xì)胞等靶器官對(duì)胰島素的生理作用反應(yīng)性下降或敏感性降低，其中脂肪組織在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，肥胖和脂肪性營養(yǎng)不良都可能引起胰島素抵抗。本實(shí)驗(yàn)采用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1脂肪7 d后，在有或無胰島素刺激下，地塞米松組的細(xì)胞葡萄糖消耗量均較正常組明顯減少，提示胰島素抵抗模型復(fù)制成功。加入 DMY（5×10－7～1×10－8mol·L－1）后，無論有或無胰島素的刺激，DMY均能增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量，提示DMY可改善地塞米松誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞形成的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。但DMY對(duì)正常3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取無明顯影響。

葡萄糖是極性分子，需借助于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，其中GLUT4介導(dǎo)了脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)［9］?；A(chǔ)狀態(tài)下，GLUT4主要分布在細(xì)胞內(nèi)的囊泡中，在胰島素刺激下，GLUT4大量易位至細(xì)胞膜，將細(xì)胞外的葡萄糖攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。GLUT4表達(dá)數(shù)量的減少或易位受阻皆有可能引起胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松模型組的細(xì)胞GLUT4基因表達(dá)量較正常組明顯下調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7，10－11］，加入 DMY后脂肪細(xì)胞的 GLUT4表達(dá)量明顯增加，提示DMY改善胰島素抵抗的作用可能與上調(diào)GLUT4基因的表達(dá)量有關(guān)。

Akt是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵激酶，在PI3K的作用下被激活，活化的 Akt能直接刺激GLUT4易位到細(xì)胞膜上，從而轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖［12］。抑制Akt的基因表達(dá)或者抑制其磷酸化均能明顯抑制胰島素依賴的 GLUT4易位，產(chǎn)生胰島素抵抗。Akt主要有3種亞型，其中Akt 2分布于脂肪組織，與糖代謝密切相關(guān)［13］，參與細(xì)胞內(nèi)的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松使脂肪細(xì)胞Akt2的基因表達(dá)量明顯下降，而DMY則能促進(jìn)脂肪細(xì)胞表達(dá)Akt2，提示DMY改善胰島素抵抗的機(jī)制與上調(diào)Akt2基因的表達(dá)有關(guān)。

脂聯(lián)素是脂肪組織分泌產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，脂聯(lián)素與其受體結(jié)合后，激活A(yù)MPK信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮脂肪酸氧化、蛋白質(zhì)分解、細(xì)胞保護(hù)作用和葡萄糖攝取等多種藥理作用［14］。研究表明，脂聯(lián)素和胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)，脂聯(lián)素基因敲除小鼠可出現(xiàn)胰島素抵抗，而補(bǔ)充脂聯(lián)素可以逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗［15－17］。本研究表明地塞米松能下調(diào)脂聯(lián)素基因的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［18］。而加入DMY作用后能明顯上調(diào)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂聯(lián)素基因表達(dá)量，提示促進(jìn)脂聯(lián)素基因的表達(dá)可能是DMY改善胰島素抵抗的另一機(jī)制。

綜上所述，DMY在有或無胰島素刺激下均能增加地塞米松誘導(dǎo)的胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量，改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，同時(shí)不影響正常脂肪細(xì)胞的糖攝取。DMY改善胰島素抵抗的機(jī)制可能與上調(diào)胰島素信號(hào)通路中的Akt2和GLUT4的基因表達(dá)，以及上調(diào)脂聯(lián)素基因的表達(dá)有關(guān)，但是DMY是否能促進(jìn)Akt2的磷酸化和GLUT4的易位還有待進(jìn)一步的研究。

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