查雨鋒，張 順，蘇 航，劉 亭，傅曉鐘，董永喜，王愛民，王永林

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心、2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004）

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是存在于血液與腦組織間的一道生理屏障，對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要作用。它的存在使處于循環(huán)中的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)無法輕易透過其進(jìn)入大腦組織，從而保護(hù)大腦不被血液內(nèi)的微生物和毒素傷害［1］，但同時也導(dǎo)致絕大多數(shù)藥物無法進(jìn)入大腦組織，使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的開發(fā)受到巨大阻礙。尋找新的腦靶向給藥系統(tǒng)以及與之相對應(yīng)的篩選工具將是今后藥學(xué)研究的重點(diǎn)，由于整體實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和影響因素的多重性，使得對新藥透過BBB的篩變得困難，而體外BBB模型避免了體內(nèi)研究的多種復(fù)雜干擾因素，被廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)中預(yù)測其BBB通透能力的重要工具［2］。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain-microvessl endothelial cells，BMECs）是建立體外BBB模型的重要材料，而如何獲得高純度的BMECs一直是建立體外BBB的關(guān)鍵和難點(diǎn)。目前，國內(nèi)外關(guān)于BMECs的分離方法有篩網(wǎng)法、酶消化法及組織塊法［3－4］，但這些方法都不能夠有效獲得高純度及高活力的BMECs。本研究參照國內(nèi)外報道的篩網(wǎng)法［5］和酶消化法［6］，摸索出了獲得高純度和高活力BMECs的分離及培養(yǎng)方法。

1 材料

1.1 動物 10 d的 SD大鼠5只，♀♂均可，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房提供，動物合格證號：SCXK（黔）2012－0001。

1.2 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（批號8114031）、胎牛血清（FBS，批號1227694）、胰蛋白酶（批號J130049）均購自Gibco公司；青霉素－鏈霉素（批號15140－122）購自Hyclone公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，批號1210432）購自Pepro Tech公司；牛血清白蛋白（BSA，批號1213G051）、Ⅱ型膠原酶（批號 C6885）、D-NaseⅠ酶（批號 D8071）、鼠尾膠原蛋白（批號 C8062）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，批號705B054）、TritionX-100（批號 T8200）、肝素鈉（批號H8060）、胰島素（批號1205A025）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（批號823A0410）、L-谷氨酰胺（批號 312A043）、Percoll（批號305A046）、蘇木精（批號20130624）均購自 Solarbio公司；亞硒酸鈉（批號10102-18-8）購自Amresco公司；膠原酶／分散酶（批號14093221）購自Roche公司；4%多聚甲醛（批號07K29C68）購自博士德生物公司；兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體（批號bs-2974R）購自Bioss公司；D-Hanks緩沖液（自配）；SP免疫組化試劑盒（批號SP-9001）、DAB顯色試劑盒（批號ZLI-9018）購自中杉金橋公司。

1.3 儀器 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（corning，USA）；數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠）；超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo scientific公司）；Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)（美國Beckman）；倒置顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 大鼠BMECs的原代培養(yǎng) 取5只新生10 d的SD大鼠，無菌條件下取腦，分離并收集灰質(zhì)于冷DMEM培養(yǎng)液中。將收集到的大腦灰質(zhì)用D-Hanks液清洗3次后，剪成1 mm3左右大小，加入5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Ⅱ型膠原酶（內(nèi)含0.005%D-NaseⅠ）懸浮混勻后用5 ml吸管吹打30次，37℃振蕩消化40 min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的膠原酶／分散酶共同消化40 min，4℃，800×g離心5 min。棄上清液，添加適量DMEM培養(yǎng)液混勻后通過100目的篩網(wǎng)，收集濾液，800×g離心5 min。將沉淀加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的BSA混懸后，4℃，1 000×g離心20 min，取底部沉淀。將沉淀用DMEM培養(yǎng)液洗1次，4℃，800×g離心5 min，棄上清液，平鋪于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44%的連續(xù)percoll離心液表面，4℃，1 000×g離心10 min，離心后取靠近底部紅色沉淀的黃白色部分，DMEM培養(yǎng)液清洗1次后離心，即得到純度較高的微血管段（注：以上操作均在冰上進(jìn)行）。用7 ml含20%FBS的高糖 DMEM（另含 bFGF 2μg·L－1；肝素鈉100 mg·L－1；牛胰島素 50 mg·L－1；cAMP 312.4μmol·L－1；轉(zhuǎn)鐵蛋白 5 mg·L－1；亞硒酸鈉 2μg·L－1；L-谷氨酰胺 2.5 mmol·L－1；青霉素1×105U·L－1；鏈霉素100 mg·L－1）懸浮后接種于涂有鼠尾膠的培養(yǎng)瓶中，最后加入4 mg·L－1的嘌呤霉素，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后換液，培養(yǎng)48 h后換不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，隨后隔1 d換1次培養(yǎng)液。

2.2 大鼠BMECs的傳代 大鼠BMECs長至單層時，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%的胰酶（含0.01%EDTA）消化，并于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓，間隙增大時，加入2～3 ml含有血清的培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞脫落，800×g離心5 min，棄上清液，按1∶2的傳代方式接種于鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中，用含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)，每天換1次液。

2.3 大鼠BMECs的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué) 將培養(yǎng)有BMECs的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁、生長狀況及形態(tài)，并進(jìn)行拍照。

2.3.2 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定 將擴(kuò)增培養(yǎng)的BMECs以每孔100萬個細(xì)胞的密度接種于涂有鼠尾膠的6孔板中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿板底時吸出培養(yǎng)液，給予4%的多聚甲醛固定1 h，PBS沖洗3次（每次3 min），按照SP免疫組化試劑盒說明書依次操作，兔抗大鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體按1∶200稀釋。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，于倒置顯微鏡下觀察，以胞質(zhì)呈現(xiàn)棕色信號為陽性細(xì)胞，陰性對照用PBS代替兔抗Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體。

2.4 BMECs生長曲線的繪制 分別繪制BMECs在普通培養(yǎng)基（即含有 20%FBS，bFGF 2μg·L－1，肝素鈉 100 mg·L－1，L-谷氨酰胺2.5 mmol·L－1，青霉素 1×105U·L－1，鏈霉素100 mg·L－1的高糖 DMEM）和生長培養(yǎng)基（即含有20%FBS，bFGF 2μg·L－1，肝素鈉 100 mg·L－1，牛胰島素50 mg·L－1，cAMP 312.4μmol·L－1，轉(zhuǎn)鐵蛋白 5 mg·L－1，亞硒酸鈉 2μg·L－1，L-谷氨酰胺 2.5 mmol·L－1，青霉素 1×105U·L－1，鏈霉素100 mg·L－1的高糖 DMEM）的生長曲線。取2～3代的BMECs，每孔20萬個細(xì)胞接種于96孔板中，采用MTT法測定1周內(nèi)每天的細(xì)胞活力。每天測定10個復(fù)孔，取平均值。最后以時間（d）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)描繪一條曲線，即為BMECs的生長曲線。

3 結(jié)果

3.1 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將提取得到的腦微血管段置于倒置顯微鏡下觀察，微血管段表面光滑，長短不一，呈單枝或多枝狀，也有呈串珠狀，有部分被分散成小碎段和單個細(xì)胞。2 h后微血管段貼壁，并有內(nèi)皮細(xì)胞爬出生長。48 h后細(xì)胞融合為單層，細(xì)胞呈梭形和多角形。72 h后細(xì)胞呈典型的鋪路卵石樣結(jié)構(gòu)，并呈“漩渦狀”分布，其形態(tài)與文獻(xiàn)報道相似［7］。

Fig 1 Morphology of BMEC（×100）A：Brain microvascular section obtained by primitive extract；B：BMECs culture for 2 h；C：BMECs culture for 48 h；D：BMECs culture for 72 h

3.2 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定 經(jīng)DBA顯色后，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

Fig 2 Factor-VIII relative antigen immunohistochemistry identification（×200）A：Negative control；B：Positive control

3.3 BMECs生長曲線的繪制 在生長培養(yǎng)基中，BMECs從d 2開始進(jìn)入對數(shù)生長期，生長高峰在3～4 d，d 5后生長趨于穩(wěn)定。與在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)相比，BMECs在普通培養(yǎng)基中的生長速度較慢，生長周期延長，細(xì)胞活力偏低，如Fig 3所示。

Fig 3 Growth curve for BMECsa：Cultured in ordinary medium；b：Cultured in growth medium

3.4 嘌呤霉素對BMECs純化的考察 在培養(yǎng)介質(zhì)中加入4 mg·L－1的嘌呤霉素培養(yǎng)48 h，可有效抑制雜細(xì)胞的生長。而未加入嘌呤霉素培養(yǎng)48 h后，可見大量有突觸的雜細(xì)胞生長，如Fig 4所示。

Fig 4 Investigation on purification of BMECs by using puromycin（×200）A：Culture without puromycin，a large number of parenchyma cell growth can be observed；B：Culture with puromycin for 48 h，no obvious parenchyma cell growth can be observed.

4 討論

目前，國內(nèi)外有關(guān)BMECs的分離大多采用篩網(wǎng)法和兩次酶分步消化法，但這兩種方法都有缺陷。采用篩網(wǎng)法細(xì)胞得率較低，往往需要大量實(shí)驗(yàn)動物；另外，勻漿過程對細(xì)胞損傷較大，所得細(xì)胞活力較低，接種后難以存活，而且還摻雜有較多雜細(xì)胞。而采用兩次酶分步消化法所分離的細(xì)胞雖存活率和細(xì)胞得率都有所提高，但其耗時較長，并且所得到的微血管段中雜有大量動脈和靜脈血管，最后培養(yǎng)得到的內(nèi)皮細(xì)胞并非完全為BMECs；另外，由于消化時間過長，微血管段大多被分解成小碎段，這對于BMECs的活力是有很大影響的。此外，還有相關(guān)文獻(xiàn)報道，采用勻漿法與兩次分步酶消化法相結(jié)合［8］，這不僅可以縮短消化時間，還可以獲得較完整的微血管段，但本研究通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，勻漿對BMECs的損傷是巨大的，雖用縮短消化時間來彌補(bǔ)勻漿帶來的損傷，但最終結(jié)果也不是很理想。針對以往分離方法的不足，本研究摸索出既可以分離得到高純度BMECs，又能有效縮短分離時間和最大程度提高細(xì)胞活力的分離培養(yǎng)方法，本方法分離得到的BMECs培養(yǎng)周期較短，為3～4 d，明顯低于相關(guān)文獻(xiàn)報道［9－10］，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。該方法的總結(jié)主要如下：①鑒于分散酶主要作用于細(xì)胞基底膜，作用溫和，對細(xì)胞膜傷較小的特點(diǎn)，本研究采用Ⅱ型膠原酶，分散酶／膠原酶連續(xù)消化法，即先加入Ⅱ型膠原酶消化40 min，再繼續(xù)加入分散酶／膠原酶，兩種酶共同作用消化40 min，與兩次酶分步消化相比，消化結(jié)果相同，但縮短了近一半的消化時間［11－13］，從而較好的保留了細(xì)胞活力。②采用100目篩網(wǎng)對消化好的組織進(jìn)行過濾，可將未分散開的組織團(tuán)塊及大血管如靜脈和動脈有效去除，使分離出的微血管段更為純凈。③所有操作均在冰上進(jìn)行，以最大限度的保留細(xì)胞活力。④基于BMECs高度表而其他細(xì)胞較少表達(dá)P-糖蛋白，因此在培養(yǎng)介質(zhì)中加入P-糖蛋白底物嘌呤霉素培養(yǎng)48 h，可有效殺滅雜細(xì)胞，從而進(jìn)一步提高細(xì)胞純度［14］。⑤加入微量的細(xì)胞培養(yǎng)添加物，如胰島素、cAMP、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞生長，縮短生長周期，這可能與其促進(jìn)細(xì)胞的物質(zhì)代謝有關(guān)。⑥與采用明膠包被的培養(yǎng)瓶相比，鼠尾膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶更利于BMECs的生長。⑦共考察了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%、44%和55%3個濃度percoll離心液的分離效果，發(fā)現(xiàn)隨著percoll離心液濃度的升高，微血管段層距底部的紅細(xì)胞和周細(xì)胞層就越遠(yuǎn)，但細(xì)胞得率也會逐漸降低，最后本研究采用了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44%的percoll作為離心介質(zhì)，這樣既可以保證細(xì)胞得率，又能將其與雜細(xì)胞較好分離。⑧文獻(xiàn)報道，BMECs接種1 h后開始貼壁，4 h貼壁率達(dá)60%以上［15］，而膠質(zhì)細(xì)胞的貼壁高峰在6 h以后。而本研究發(fā)現(xiàn)，采用本方法獲得和培養(yǎng)的BMECs在接種2 h后貼壁率就可達(dá)到90%以上，因此選擇在接種后2 h換全液，可以有效去除雜細(xì)胞。⑨根據(jù)BMECs較容易消化脫落的特性，采用分次收集消化液的方式對其進(jìn)一步純化，反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，較先脫落的70%部分含雜細(xì)胞較少。本方法能夠獲得高產(chǎn)率的BMECs，重現(xiàn)性較好，操作相對簡單，并且所得到的細(xì)胞純度和活力都相對較高，為體外BBB的建立以及對大腦疾病致病機(jī)制的研究提供了技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。

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