蔡文杰，王銘潔

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教研室，上海 200093；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032）

趨化是指細(xì)胞隨環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的分布梯度作定向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象［1］。許多細(xì)胞具有感受環(huán)境中趨化因子的能力，從而產(chǎn)生特定的生理與病理生理現(xiàn)象。比如細(xì)菌釋放炎癥因子，中性粒細(xì)胞感知后能朝向炎癥部位運(yùn)動(dòng)，最終到達(dá)該部位，發(fā)揮吞噬功能，起到免疫防護(hù)作用［2］。在創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生、干細(xì)胞歸巢以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中也都存在趨化現(xiàn)象［3］。本研究通過建立活細(xì)胞定向遷移研究平臺(tái)，探索在體外評價(jià)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和趨化能力的標(biāo)準(zhǔn)，為細(xì)胞遷移信號通路的研究提供實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 蔡司倒置顯微鏡，Eppendorf顯微操縱儀、顯微注射儀和毛細(xì)管針，腔室蓋玻片（丹麥NUNC公司）。HL-60細(xì)胞株（ATCC），DMSO、牛血漿來源纖連蛋白、N-甲酰甲硫氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸（N-formylmethionyl-leucylphenyl-alanine，fMLP）和 AS605240（美國 SIGMA公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞株成為中性粒細(xì)胞 人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株（HL-60）在體積分?jǐn)?shù)為0.20的胎牛血清－RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，用體積分?jǐn)?shù)為0.013的 DMSO處理細(xì)胞5～6 d，誘導(dǎo)其分化為中性粒細(xì)胞。

1.2.2 慢病毒介導(dǎo)基因表達(dá) 把PH-Akt-GFP克隆到慢病毒表達(dá)載體FUW2中，將其與另外3個(gè)質(zhì)粒pMDL、pRSV、pCMV同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，2～3 d后將培養(yǎng)液超速離心得到病毒顆粒。慢病毒感染HL-60細(xì)胞后通過流式細(xì)胞術(shù)分選陽性細(xì)胞，最終得到表達(dá)PH-Akt-GFP的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.2.3 準(zhǔn)備供成像的活細(xì)胞 中性粒細(xì)胞離心后用改良HBSS緩沖液（137 mmol·L－1NaCl，4 mmol·L－1KCl，1.2 mmol·L－1MgCl2，10 mmol·L－1glucose和 20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4）洗滌，再次離心后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的BSA緩沖液重懸細(xì)胞，接種于預(yù)先用100 mg·L－1人纖連蛋白包被的腔室蓋玻片，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，換液后去除未貼壁細(xì)胞。

1.2.4 準(zhǔn)備顯微鏡和顯微注射系統(tǒng) 趨化因子（1μmol·L－1fMLP）用 0.22μm濾膜過濾，離心 5 min（10 000 r·min－1）去除未溶解雜質(zhì)。毛細(xì)管針內(nèi)注入10μl fMLP后安裝于顯微注射儀上，鏡下確認(rèn)針尖端通暢且無氣泡。

1.2.5 顯微成像 研究單細(xì)胞遷移和趨化時(shí)，采用低倍（100～200倍）光鏡拍攝，圖像采集間隔為30～60 s。研究信號分子和骨架的動(dòng)態(tài)分布時(shí)，采用高倍（400～630倍）熒光顯微鏡（或者激光共聚焦）拍攝，圖像采集間隔為5 s到10 s。

1.2.6 數(shù)據(jù)評價(jià) 用遷移速度（motility speed）、趨化速度（chemotaxis motility）、趨化指數(shù)（chemotaxis index）和持續(xù)性（persistency）來評價(jià)采集到的數(shù)據(jù)。得到的結(jié)果以ˉx±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析方法比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 fMLP可促進(jìn)中性粒細(xì)胞隨機(jī)遷移 無fMLP處理的HL-60遷移速率為（1.40±0.28）μm·min－1，fMLP處理后細(xì)胞遷移速率明顯增加，達(dá)到（5.94±0.38）μm·min－1，見Fig 1。

2.2 fMLP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞定向遷移 在未放置含1 μmol·L－1fMLP的毛細(xì)管針時(shí)，細(xì)胞隨機(jī)運(yùn)動(dòng)。當(dāng)把毛細(xì)管針放置到觀察視野中心位置底面時(shí)候，很快引起細(xì)胞出現(xiàn)暫時(shí)性的鋪展。在2 min內(nèi)，細(xì)胞分辨出fMLP的方向，開始朝向毛細(xì)管針遷移，直到到達(dá)針尖處（趨化因子濃度最高點(diǎn)）。見Fig 2。

2.3 AS605240抑制中性粒細(xì)胞定向遷移 細(xì)胞預(yù)先使用PI3K抑制劑 AS605240（10μmol·L－1）或其溶劑 DMSO處理30min，然后將含1μmol·L－1fMLP毛細(xì)管針放置到視野中，開始記錄細(xì)胞的遷移情況。用Image J軟件分析趨化的各種指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)AS605240處理后的細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，遷移速度降低（1.94±0.21）vs（3.12±0.24）μm·min－1，趨化速度降低（0.51±0.13）vs（1.01±0.21）μm·min－1，趨化指數(shù)減少（0.19±0.03）vs（0.36±0.05），持續(xù)性變差（0.29±0.04）vs（0.47±0.05），且差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 3）。

Fig 1 fMLP promotes random migration of HL-60 neutrophils（n＝21）A：Control；B：100 nmol·L－1 fMLP treated.P＜0.01.

Fig 2 Directional migration of HL-60 neutrophils towards fMLP gradientA：0 min；B：1.5 min；C：24 min；D：Migrating tracks.

Fig 3 AS605240 inhibits directional migration of HL-60 neutrophils towards fMLP gradientA：Migration track of DMSO treated cells；B：Migration track of AS605240 treated cells；C：Statistics of motility speed and chemotaxis speed；D：Statistics of chemotaxis index and persistency.*in A and B indicates the location of micropipette.In C and D，*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group.

2.4 信號分子標(biāo)記物在活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)分布 含1μmol·L－1fMLP毛細(xì)管針放置到視野中后，引起細(xì)胞膜PIP3產(chǎn)生增加，PH-Akt-GFP熒光標(biāo)記物轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上；1 min后，PIP3的產(chǎn)生主要發(fā)生在細(xì)胞前端朝向高濃度fMLP處；重置毛細(xì)管針引起fMLP濃度梯度方向的改變，進(jìn)而導(dǎo)致PH-Akt-GFP熒光標(biāo)記物發(fā)生重定位，朝向新的濃度梯度（Fig 4）。

Fig 4 PIP3 probe PH-Akt-GFP relocate with fMLP micropipetteA：10 sec；B：1 min；C：Relocation of the micropipette.*indicates the location of micropipette.Arrows show local accumulation of PH-Akt-GFP on the plasma membrane.

3 討論

趨化通常包括方向感知、細(xì)胞極化和運(yùn)動(dòng)3個(gè)過程［4］，但這幾個(gè)過程并不是完全獨(dú)立的，而是相輔相成的。細(xì)胞通過膜上的趨化受體感知外界信號，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，把環(huán)境中微弱的趨化因子濃度差異轉(zhuǎn)換為細(xì)胞膜上明顯的信號分子分布差異，進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的分子進(jìn)行重分布，細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)上變長，其中一端成為前端，另一端成為后端或稱為尾端。前端的信號蛋白如Rac等引起肌動(dòng)蛋白聚合［5］，后者又通過一種正反饋機(jī)制激活 PI3K，使得極性增強(qiáng)。PI3K活化后催化PIP2生成PIP3，PIP3可以結(jié)合蛋白的PH功能域，因此，當(dāng)細(xì)胞過表達(dá)PH功能域后就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞PI3K的活化狀況［6］。中性粒細(xì)胞對fMLP的反應(yīng)以PI3Kγ的激活最為重要［7］，因此，當(dāng)利用了 PI3Kγ特異性的抑制劑AS605240后，細(xì)胞的趨化能力明顯降低。

評價(jià)細(xì)胞趨化能力的常用指標(biāo)有遷移速度、趨化速度、趨化指數(shù)和持續(xù)性［8］，其中，遷移速度是指細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)實(shí)際遷移了多少距離，趨化速度是指細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)向趨化源遷移了多少有效距離，趨化指數(shù)是指趨化速度除以遷移速度得到的商，持續(xù)性是指起點(diǎn)和終點(diǎn)的直線距離除以遷移的總距離。這些指標(biāo)綜合起來可以較好地反映出細(xì)胞對趨化源的反應(yīng)能力和自身的趨化能力。

目前，常用的檢測細(xì)胞遷移的方法有細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)等［9］，這些方法簡單有效，不需要特殊的儀器設(shè)備，缺點(diǎn)是數(shù)據(jù)比較籠統(tǒng)，反映的是群體遷移，不能完全排除細(xì)胞增殖的影響，不能分辨出細(xì)胞對所加藥物是否具有趨化性。在我們的實(shí)驗(yàn)中，藥物通過毛細(xì)管針緩慢釋放，維持一定的濃度梯度，從而可以很好地觀察細(xì)胞對藥物的反應(yīng)能力，而且，我們是對單細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，因此得到的信息量很大，可以進(jìn)行多種后續(xù)分析。但該方法對顯微鏡要求比較高，需要得到高質(zhì)量的圖像，這樣才能通過軟件把細(xì)胞與背景區(qū)分開，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的自動(dòng)分析。雖然在我們的實(shí)驗(yàn)中用的是快運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，但相關(guān)方法也同樣適用于慢運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的趨化，因此，該方法應(yīng)用前景廣泛。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Jin T.Gradient sensing during chemotaxis［J］.Curr Opin Cell Biol，2013，25（5）：532－7.

［2］ Kolaczkowska E，Kubes P.Neutrophil recruitment and function in health and inflammation［J］.Nat Rev Immunol，2013，13（3）：159－75.

［3］ Martins M，Warren S，Kimberley C，et al.Activity of PLCεcontributes to chemotaxis of fibroblasts towards PDGF［J］.J Cell Sci，2012，125（Pt 23）：5758－69.

［4］ Cai H，Devreotes P N.Moving in the right direction：how eukaryotic cells migrate along chemical gradients［J］.Semin Cell Dev Biol，2011，22（8）：834－41.

［5］ 姚紅伊，顏小鋒，吳希美.Rac小G蛋白與中性粒細(xì)胞趨化研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（11）：1407－9.

［5］ Yao H Y，Yan X F，Wu X M.Progress in the study between Rac GTPase and neutrophil chemotaxis［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（11）：1407－9.

［6］ Cain R J，Ridley A J.Phosphoinositide3-kinases in cell migration［J］.Biol Cell，2009，101（1）：13－29.

［7］ Ferguson G J，Milne L，Kulkarni S，et al.PI（3）K gamma has an important context-dependent role in neutrophil chemokinesis［J］.Nat Cell Biol，2007，9（1）：86－91.

［8］ Tang M，Iijima M，Kamimura Y，et al.Disruption of Pkb signaling restores polarity to cells lacking tumor suppressor pten［J］.Mol Biol Cell，2011，22（4）：437－47

［9］ 胡劍江，雷洪濤，侯燕鳴，王 毅.腫瘤細(xì)胞遷移過程的動(dòng)態(tài)評估方法［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（1）：128－31.

［9］ Hu JJ，Lei H T，Hou Y M，Wang Y.A new evaluation method for tumor cell migration process［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（1）：128－31.