本刊編輯部

（上海交通大學(xué)，上海 200030）

1 掀開(kāi)了新篇章

今年6月，我們研究組在Nature上發(fā)表了題為“Crystal structure of the human glucose transporter GLUT1”的論文，在世界上首次報(bào)道了人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)，初步揭示其工作機(jī)制以及相關(guān)疾病的致病機(jī)理，在國(guó)際上影響較大，現(xiàn)在先對(duì)研究課題內(nèi)容及情況做些介紹。

（1）葡萄糖（D-glucose）是地球上包括從細(xì)菌到人類各種生物已知最重要、最基本的能量來(lái)源，也是人腦和神經(jīng)系統(tǒng)最主要的供能物質(zhì);據(jù)估算，大腦平均每天消耗約120g葡萄糖，占人體葡萄糖總消耗量的一半以上。葡萄糖代謝的第一步就是進(jìn)入細(xì)胞：親水的葡萄糖不能自由穿透疏水的細(xì)胞膜，其進(jìn)出細(xì)胞需要通過(guò)鑲嵌于細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成。其中一類屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily，簡(jiǎn)稱MFS）的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它是大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、紅細(xì)胞等組織器官中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporters，簡(jiǎn)稱GLUTs）。在人體的14個(gè)GLUTs中，GLUT1、2、3、4 這四種蛋白生理功能最重要，研究最廣泛，其中GLUT1（圖1）因發(fā)現(xiàn)最早而得名。

圖1 人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)

GLUT1幾乎存在于人體每一個(gè)細(xì)胞中，是紅細(xì)胞和血腦屏障等上皮細(xì)胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)于維持血糖濃度的穩(wěn)定和大腦供能起關(guān)鍵作用。在已知的人類遺傳疾病中，導(dǎo)致GLUT1功能異常的突變會(huì)影響葡萄糖的正常吸收，導(dǎo)致大腦 萎縮、智力低下、發(fā)育遲緩、癲癇等一系列的疾?。℅LUT1 Deficiency syndrome，又稱De Vivo syndrome）。另一方面，當(dāng)發(fā)生癌變時(shí)，葡萄糖是腫瘤細(xì)胞最主要的能量來(lái)源，但是腫瘤細(xì)胞由于缺乏氧氣供應(yīng)而只能對(duì)葡萄糖進(jìn)行無(wú)氧代謝，同質(zhì)量葡萄糖所提供的能量不到正常細(xì)胞的10%，因而對(duì)葡萄糖的需求劇增（這是被稱為Warburg Effect的腫瘤細(xì)胞代謝現(xiàn)象），在很多種類的腫瘤細(xì)胞中都觀察到GLUT1的超量表達(dá)，以大量攝入葡萄糖維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)增，這使得GLUT1的表達(dá)量可能作為檢測(cè)癌變的一個(gè)指標(biāo)。

（2）葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究歷史基本上代表了人類理解物質(zhì)跨膜運(yùn)輸?shù)臍v史。將近100年前，就觀測(cè)到紅細(xì)胞對(duì)葡萄糖的飽和性吸收;起初認(rèn)為葡萄糖是通過(guò)自由跨膜擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的，隨著實(shí)驗(yàn)證據(jù)的積累，1948年，LeFevre等首次提出葡萄糖的進(jìn)入紅細(xì)胞的跨膜擴(kuò)散需要細(xì)胞膜上的特定組分（蛋白質(zhì)）參與;1952年，Widdas等通過(guò)對(duì)人體紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的動(dòng)力學(xué)研究提出了飽和運(yùn)載體機(jī)制（saturable carrier mechanism），理論上揭示了細(xì)胞膜上運(yùn)載體（carrier）的存在（盡管之后的研究并不再支持這轉(zhuǎn)運(yùn)模型，但至今許多跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白仍然以carrier命名，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族以SLC分類）;1977年，Kasahara和Hinkle從人體紅細(xì)胞提純分離出了參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白，并實(shí)現(xiàn)了脂質(zhì)體重構(gòu)功能實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在;1985年，Harvey Lodish實(shí)驗(yàn)室首次鑒定出了人體GLUT1蛋白的基因序列，并根據(jù)氨基酸序列預(yù)測(cè)了其具有12次跨膜區(qū)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu);1991年，De Vivo等首次報(bào)道了與GLUT1突變體相關(guān)的疾病癥狀，并將這一大類與GLUT1突變相關(guān)的疾病命名為De Vivo綜合癥，展示了GLUT1與人類健康的緊密關(guān)聯(lián)。

自從獲得了大量生理、病理、細(xì)胞、生化信息之后，獲取GLUT1的三維結(jié)構(gòu)就變成了該領(lǐng)域最期待的下一個(gè)突破。為了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，科學(xué)家嘗試了從紅細(xì)胞中、動(dòng)物組織中直接提取GLUT1或者通過(guò)重組表達(dá)的方法獲取;同時(shí)還嘗試通過(guò)研究GLUT1-4的同源蛋白結(jié)構(gòu)信息來(lái)間接理解這些重要的人源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。上個(gè)世紀(jì)80年代，Henderson等報(bào)道了數(shù)個(gè)與GLUT具有序列同源性的細(xì)菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;90年代，一系列工作報(bào)道了GLUT1蛋白在多種表達(dá)體系中的重組表達(dá);真正的結(jié)構(gòu)生物學(xué)突破發(fā)生于2012年，我們研究組首次解析了GLUTs的大腸桿菌同源蛋白XylE與葡萄糖結(jié)合的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，并利用同源建模預(yù)測(cè)了GLUT1-4的三維結(jié)構(gòu);現(xiàn)在，人源GLUT1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的捕獲為我們理解這個(gè)具有歷史研究意義的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白掀開(kāi)了新的篇章。

2 培養(yǎng)隊(duì)伍持之以恒

我們研究組所以能夠在激烈的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中率先解析GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)源于我們這些年來(lái)對(duì)于MFS家族的深入理解和研究積淀。我們實(shí)驗(yàn)室在2007年成立之日就將GLUTs作為主要研究對(duì)象，然而作為結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域最為困難的膜蛋白、尤其是真核膜蛋白的研究，首先要培養(yǎng)一支研究隊(duì)伍。我們從相對(duì)簡(jiǎn)單的細(xì)菌同源蛋白開(kāi)始著手，邊培養(yǎng)學(xué)生邊積累經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，2010年解析了大腸桿菌中巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FucP的晶體結(jié)構(gòu)（Dang et al，Nature，2010），2012年解析木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白XylE的晶體結(jié)構(gòu)（Sun et al，Nature，2012）。在研究這些同家族糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)與機(jī)理過(guò)程中，對(duì)于 MFS家族的工作機(jī)理有了深入了解，分析出GLUT1結(jié)晶的瓶頸在于高度動(dòng)態(tài)、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。針對(duì)這一問(wèn)題，我們著手尋找可以將GLUT1鎖定于某一構(gòu)象的致病突變體，同時(shí)利用低溫結(jié)晶進(jìn)一步穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，終于克服了GLUT1重組表達(dá)、純化結(jié)晶的一系列技術(shù)障礙，我們終于獲得了GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)（圖2）。

GLUT1的三維晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)經(jīng)典的MFS家族折疊方式——12個(gè)跨膜螺旋組成N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的腔孔朝向胞內(nèi)區(qū)，即該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)向內(nèi)開(kāi)放構(gòu)象。而在結(jié)晶中用到的去污劑頭部恰好是葡萄糖苷，其結(jié)合位點(diǎn)與此前XylE中觀測(cè)到的葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)基本重合，證實(shí)了MFS家族具有單一結(jié)合位點(diǎn)。有趣的是，GLUT1在胞內(nèi)可溶區(qū)還具有一個(gè)由4個(gè)α螺旋組成的結(jié)構(gòu)域（簡(jiǎn)稱ICH），這一序列只在MFS中的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族中（Sugar Porter subfamily）觀察到，因此ICH是屬于該家族蛋白的特有結(jié)構(gòu)特征。利用GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)可以精確地定位與疾病相關(guān)的突變氨基酸，揭示其致病機(jī)理。分析顯示，30余個(gè)突變氨基酸基本集中于3個(gè)區(qū)域：底物結(jié)合區(qū)域、胞外門(mén)控區(qū)、胞內(nèi)門(mén)控區(qū)，它們的突變或者影響了底物識(shí)別，或者影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的構(gòu)象變化。晶體結(jié)構(gòu)使得理解這些致病突變的機(jī)理一目了然。與之前獲得的向胞外半開(kāi)口的XylE晶體結(jié)構(gòu)比較揭示出ICH在GLUT1的構(gòu)象變化中起關(guān)鍵作用。鑒于ICH在糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族的保守性，這一發(fā)現(xiàn)可能適用于該亞家族所有成員。

至此，我們實(shí)驗(yàn)室一個(gè)接一個(gè)分別捕獲了FucP向胞外開(kāi)放，XylE結(jié)合底物半開(kāi)放，GLUT1向胞內(nèi)開(kāi)放的3個(gè)MFS家族最具有代表性的轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)比對(duì)初步揭示出MFS糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)循環(huán)中的構(gòu)象變化，對(duì)于理解MFS家族糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程提供了重要的分子基礎(chǔ)。

我們研究組（圖3）是一個(gè)比較年輕的團(tuán)隊(duì)，我本人屬于“70后”，這項(xiàng)研究成果的第一作者鄧東博士屬于“80后”，是PTN（北京大學(xué)、清華大學(xué)和北京生命科學(xué)研究所聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生項(xiàng)目）的第一位畢業(yè)生，其博士階段針對(duì)TAL effector特異識(shí)別DNA分子機(jī)制的研究曾經(jīng)入選2012年Science評(píng)選的年度十大進(jìn)展及2012年度中國(guó)科學(xué)十大進(jìn)展。目前鄧東為清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心（CLS）的博士后;共同第一作者徐超和吳建平屬于“90后”，2012年于清華大學(xué)生命學(xué)院獲得本科學(xué)位后加入CLS博士研究生項(xiàng)目，目前為博士二年級(jí);共同第一作者孫鵬程來(lái)自生命學(xué)院01班，于大二暑假加入到我的實(shí)驗(yàn)室，即開(kāi)始參與GLUT1的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，目前已被CLS錄取，將于今年9月正式成為CLS的博士研究生。此外，本科來(lái)自于化生基科班、現(xiàn)為生命學(xué)院五年級(jí)博士研究生的閆創(chuàng)業(yè)和本科來(lái)自于數(shù)理基科班、現(xiàn)為CLS一年級(jí)博士生的胡名旭也對(duì)本工作做出了重要貢獻(xiàn)。

圖3 課題組部分成員

另外，我們團(tuán)隊(duì)的此項(xiàng)工作獲得了自然科學(xué)基金委、科技部、CLS的經(jīng)費(fèi)支持。我本人自2012年起受到國(guó)家自然科學(xué)基金委杰出青年基金和HHMI國(guó)際青年科學(xué)家項(xiàng)目資助、2013年獲得青年拔尖人才計(jì)劃資助。特別值得一提的是，上海同步輻射光源（SSRF）為及時(shí)收集高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù)提供了必不可少的保障。這些都是我們團(tuán)隊(duì)取得成功的基本條件。