孫剛，薛睿聰，劉晨，董吁鋼

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部，2衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080)

新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)方法的比較*

孫剛，薛睿聰，劉晨，董吁鋼△

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部，2衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510080)

目的:建立并比較新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法。方法：分別通過膠原酶+胰酶消化法和胰酶消化法對(duì)新生大鼠心肌組織進(jìn)行消化，利用貼壁時(shí)間差分離心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞，然后對(duì)收集的心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)、純度及對(duì)藥物反應(yīng)方面的檢測(cè)。結(jié)果:在細(xì)胞形態(tài)和純度方面，2種方法收集的心肌成纖維細(xì)胞沒有明顯差異，但用膠原酶+胰酶消化法可以獲得更多數(shù)量的心肌細(xì)胞;在藥物反應(yīng)方面，采用胰酶消化法獲得的心肌成纖維細(xì)胞比膠原酶+胰酶消化法具有更強(qiáng)的增殖能力。結(jié)論:采用膠原酶+胰酶消化法和胰酶消化法可以獲得相同形態(tài)和純度的心肌成纖維細(xì)胞，但是采用胰酶消化法獲得的心肌成纖維細(xì)胞對(duì)藥物具有更強(qiáng)的增殖反應(yīng)能力。

心肌成纖維細(xì)胞;膠原酶;胰酶

心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，而心肌成纖維細(xì)胞在這一過程中發(fā)揮著極其重要的作用。心肌成纖維細(xì)胞占整個(gè)心臟體積的25%，但數(shù)目占整個(gè)心臟細(xì)胞總數(shù)的60%～70%［1］，它不僅提供了心肌細(xì)胞賴以生存的結(jié)構(gòu)支架，而且還賦予心肌組織某些生理和病理學(xué)上的特征，因此，對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的研究也受到越來越多的重視［2-4］。本研究應(yīng)用血管緊張素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為刺激因素［5-6］，對(duì)目前常用的2種心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和研究提供了一定的依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

出生1～2 d的SD乳鼠(清潔級(jí)，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和D-Hanks液購于HyClone;0.25%胰蛋白酶(含EDTA)和I型膠原酶購自Gibco;抗vimentin、抗von Willebrand factor、抗desmin和抗Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collagen type I alpha 1 chain，Col1A1)抗體購自Santa Cruz Biotechnology;Ang II購自Anaspec;BCA Protein Assay Kit購于Pierce;Cell Counting Kit-8(CCK-8)購于Dojindo Molecular Technology;5-乙炔基-2＇-脫氧尿苷(5-ethynyl-2＇-deoxyuridine，EdU)試劑盒購自Ribobio;Trizol試劑盒購自Life Technologies。

3 主要方法

3.1 心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)取1～2 d的新生SD乳鼠，乙醇消毒后開胸?cái)D出心臟，去除心底結(jié)締組織后將心室剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，以Simpson等［7］的方法為基礎(chǔ)加于改進(jìn)，分別用膠原酶+胰酶消化法和胰酶消化法對(duì)心室組織團(tuán)塊進(jìn)行消化。對(duì)于膠原酶+胰酶法，將配制好的0.05%I型膠原酶加入心肌組織，置于37℃恒溫槽振蕩約2 h，取出后倒掉膠原酶，加入0.125%胰酶放入37℃水浴箱孵育5 min，清洗并適當(dāng)吹散細(xì)胞，收集細(xì)胞至含血清的培養(yǎng)基中，反復(fù)2～3次，直至細(xì)胞團(tuán)塊消失;離心(1 000 r/min)后收集細(xì)胞，加入含血清培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁90 min［8］;對(duì)于胰酶消化法，將0.25%胰酶加入心肌組織團(tuán)塊中，37℃水浴箱振蕩約20 min，取出后吹散并收集細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中貼壁90 min;根據(jù)心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間的不同(心肌成纖維細(xì)胞貼壁快，較易附于皿底)，收集貼壁細(xì)胞并加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后傳代用于實(shí)驗(yàn)。

3.2 心肌成纖維細(xì)胞純度的鑒定我們采用免疫熒光技術(shù)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定。細(xì)胞爬片待其達(dá)到約80%融合后，進(jìn)行4%多聚甲醛固定，0.25%Triton破膜及山羊血清封閉后，加入Ⅰ抗(抗vimentin、抗von Willebrand factor和抗desmin抗體)，4℃過夜封閉;避光條件下加入Ⅱ抗孵育，4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染細(xì)胞核后置于熒光顯微鏡下觀察。

3.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)目變化將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，待其達(dá)到約80%融合時(shí)加入Ang II孵育24 h，后加入CCK-8工作液孵育3～4 h，置于450 nm波長下測(cè)細(xì)胞吸光度(A)。

3.4 EdU檢測(cè)細(xì)胞DNA的合成將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，待其達(dá)到約80%融合后加入Ang II孵育24 h，將EdU工作液以50 μmol/L的濃度加入細(xì)胞中孵育3 h，沖洗后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固化、破膜和染色，避光條件下對(duì)DNA進(jìn)行染色，最后置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

3.5 Real-time PCR采用Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定其濃度。雙鏈cDNA的合成采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系完成，總反應(yīng)體積為20 μL，其中RNA為1 μg(用無核酶水配成10 μL)，隨機(jī)引物為2 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture(10 mmol/L)1 μL，ribonuclease inhibitor 0.5 μL，M-MLV 1.5 μL，RNase-free water 1 μL，擴(kuò)增條件為:30℃10 min，42℃60 min，70℃15min，共30～35個(gè)循環(huán)。Real-timePCR通過SYBRGreenI體系在LightCycler?480 System儀器上進(jìn)行，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，后95℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，共45個(gè)循環(huán)。引物序列:Col1A1正義鏈5＇-GAGCCAGCAGATTGAGAACAT-3＇，反義鏈5＇-TACTCTCCGCTCTTCCAGTCA-3＇;GAPDH正義鏈5＇-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3＇，反義鏈5＇-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3＇。

3.6 Western blotting細(xì)胞蛋白濃度通過BCA Protein Assay Kit測(cè)定，實(shí)驗(yàn)步驟按照Zhang等［9］報(bào)道的方法。等量的蛋白提取物加入SDS分離膠后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用Ⅰ抗對(duì)目的蛋白進(jìn)行孵育過夜，加入Ⅱ抗后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行曝光。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，差異采用多個(gè)樣本均數(shù)比較的ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)2種方法培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞在分離初期均呈圓形，懸浮于培養(yǎng)基中，90 min后大多已完成貼壁，細(xì)胞伸展成梭形，胞核明顯，零星分散生長;心肌成纖維細(xì)胞生長迅速，2～3 d即可達(dá)到80%～90%的融合，如圖1所示，2 d后2種方法培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞均排列均勻，部分交叉重疊，細(xì)胞呈梭形或者多角形，可形成“編織狀”外觀，胞體較大，胞漿透明，胞核明顯，呈橢圓形，整個(gè)細(xì)胞具有明顯的折光性，無自發(fā)性搏動(dòng)，這與其他學(xué)者培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)相似［10］，所以2種方法得到的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上沒有明顯差異，都是典型的心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)。

Figure 1.The morphology of cardiac fibroblasts harvested with two culture methods(×100).A:cardiac fibroblasts harvested with collagenase+trypsin digestion;B: cardiac fibroblasts harvested with trypsin digestion.圖1 2種培養(yǎng)方法獲得的心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)

2 心肌成纖維細(xì)胞純度的鑒定

我們利用免疫熒光法對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的純度進(jìn)行檢測(cè)，視野中藍(lán)色部分為非特異細(xì)胞核分布情況，綠色部分為特異性抗體的顯色，如圖2所示，2種方法培養(yǎng)的細(xì)胞中，抗vimentin抗體表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)目的95%以上，而內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志性抗體(抗von Willebrand factor和抗desmin抗體)表達(dá)均為陰性，表明2種方法培養(yǎng)出的細(xì)胞純度無明顯差異，且都達(dá)到了95%以上。

Figure 2.The identification of cellular purity.A:anti-vimentin antibody;B:anti-desminantibody;C:anti-von Willebrand factor antibody.圖2 細(xì)胞純度的鑒定

3 心肌成纖維細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)

Ang II是最常用的刺激可增殖細(xì)胞進(jìn)行增殖生長的藥物之一［11］，在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用Ang II (10-6mol/L)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行刺激，首先通過CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)和EdU合成實(shí)驗(yàn)來分別檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞數(shù)目和DNA合成的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)條件下，2種方法獲得的細(xì)胞均能在2～3 d內(nèi)達(dá)到80%～90%的融合，藥物刺激后，用胰酶消化法獲得的心肌成纖維細(xì)胞其DNA合成能力明顯高于膠原酶+胰酶消化法獲得的細(xì)胞(圖3A)，并且在CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)中，胰酶法獲得的細(xì)胞其增殖能力也明顯高于膠原酶+胰酶法(圖3B)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。如圖4所示，在基礎(chǔ)條件下，2種方法獲得的細(xì)胞表達(dá)Col1A1 mRNA和蛋白的能力基本相同，沒有明顯的差別，加入Ang II后，2種方法獲得的心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)Col1A1 mRNA和蛋白的能力均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0，05);同時(shí)用胰酶法獲得的細(xì)胞Col1A1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均高于膠原酶+胰酶法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 3.Ang II regulated the proliferation of cardiac fibroblasts.A:DNA synthesis tested by EdU incorporation assay;B:prolifertion tested by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs collagenase+trypsin digestion group.圖3 Ang II刺激心肌成纖維細(xì)胞后增殖能力的檢測(cè)

討論

細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)于心臟細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的開展有著十分重要的作用，目前心肌細(xì)胞的培養(yǎng)已經(jīng)趨于成熟，但是心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法繁多，各有特點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求不同，對(duì)細(xì)胞的要求也有所不同，在本實(shí)驗(yàn)中我們就目前存在的2種主要的心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法，分別從形態(tài)、純度及對(duì)藥物的反應(yīng)等幾個(gè)方面進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞在形態(tài)和純度方面沒有明顯區(qū)別，但是在對(duì)藥物刺激后其細(xì)胞的增殖反應(yīng)有所差異。我們首先從細(xì)胞代謝和DNA合成2個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原酶+胰酶消化法培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞其增殖速度明顯低于胰酶消化法獲得的細(xì)胞。同時(shí)我們還對(duì)藥物刺激后細(xì)胞基因和蛋白的合成變化進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于膠原酶+胰酶消化法，胰酶消化法獲得的細(xì)胞其主要成分Col1A1 mRNA和蛋白合成也明顯增多，說明胰酶消化法獲得的細(xì)胞對(duì)藥物的增殖效應(yīng)，不論從分子水平還是細(xì)胞水平都明顯優(yōu)于膠原酶+胰酶消化組。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，胰酶主要用于心臟組織間質(zhì)蛋白的消化，其作用強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞膜的破壞性也較大，因此許多研究對(duì)于胰酶消化法培養(yǎng)細(xì)胞持否定態(tài)度，認(rèn)為其對(duì)細(xì)胞的存活有負(fù)面影響;而膠原酶(主要是I型膠原酶)作用溫和，對(duì)細(xì)胞的損傷小，長時(shí)間消化對(duì)細(xì)胞的損傷不大，故大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室傾向于采用短時(shí)間胰酶+長時(shí)間膠原酶雙酶消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)采用膠原酶+胰酶法可以獲得更多的心肌細(xì)胞，但對(duì)貼壁心肌成纖維細(xì)胞的數(shù)目沒有明顯影響，而胰酶法雖然對(duì)心肌細(xì)胞的影響較大(心肌細(xì)胞成活率明顯降低)，但是該法獲得的心肌成纖維細(xì)胞對(duì)藥物刺激后具有更強(qiáng)的增殖能力;對(duì)于這一現(xiàn)象我們可以解釋為:第一，從細(xì)胞本身方面，心肌細(xì)胞活性明顯低于心肌成纖維細(xì)胞，對(duì)外界的環(huán)境要求頗高，故采用消化強(qiáng)度較低的膠原酶+胰酶法可以獲得更多的成活心肌細(xì)胞，而心肌成纖維細(xì)胞其活力較心肌細(xì)胞強(qiáng)，對(duì)環(huán)境要求偏低，故2種方法得到的原代心肌成纖維細(xì)胞從外形和純度上都沒有明顯區(qū)別;第二，采用胰酶法時(shí)其中的膠原酶主要是對(duì)細(xì)胞間質(zhì)的膠原纖維進(jìn)行消化，在這一過程中，膠原酶是否也會(huì)對(duì)分泌膠原纖維的心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生影響目前沒有相關(guān)的研究，但在我們的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)采用胰酶法獲得的心肌成纖維細(xì)胞其對(duì)藥物刺激后的增殖能力明顯優(yōu)于膠原酶+胰酶法獲得的細(xì)胞，故我們認(rèn)為采用膠原蛋白酶消化心肌組織時(shí)也會(huì)對(duì)心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的影響。

綜上所述，在本研究中我們比較了目前較常用的2種培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞的方法，從不同的角度對(duì)其特點(diǎn)進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)采用胰酶法獲得心肌細(xì)胞的效果不理想，但從某種程度上避免了膠原蛋白酶對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的潛在損害，從而更好地保存了其自身的特點(diǎn)，為心肌纖維化研究中心肌成纖維細(xì)胞增殖模型的建立提供更好的方法依據(jù)。

Figure 4.The expression of Col1A1 mRNA and protein in cardiac fibroblasts harvested with the two methods.A: Col1A1 mRNA expression was determined by realtime PCR.The cells were treated with or without Ang II for 2 h.B:Col1A1 protein expression was determined by Western blotting.The cells were treated with or without Ang II for 24 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs collagenase+trypsin digestion group.圖4 2種方法培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞Col1A1 mRNA與蛋白的表達(dá)

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Comparison of two methods for culturing neonatal rat cardiac fibroblasts

SUN Gang，XUE Rui-cong，LIU Chen，DONG Yu-gang
(1Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，2Key Laboratory of Assisted Circulation，Ministry of Health，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:dongxg@mail.sysu.edu.cn)

AIM:To establish and compare the methods for culturing neonatal rat cardiac fibroblasts culture.METHODS:Neonatal rat hearts were isolated by collagenase+trypsin or trypsin digestion.The cardiomyocytes and cardiac fibroblasts were isolated by different attachment techniques.The cellular morphology，purity and reactions to the reagent were tested.RESULTS:For morphology and purity，no difference between the 2 methods was observed，though more myocytes were harvested by the method of collagenase+trypsin digestion.For the cellular responses to reagent，the cardiac fibroblasts harvested with trypsin digestion had more potent proliferative ability than those with collagenase+trypsin digestion.CONCLUSION:There is no difference of cellular morphology and purity in the cardiac fibroblasts isolated by collagenase+trypsin digestion and trypsin digestion，but the fibroblasts with trypsin digestion have more potent proliferative ability.

Cardiac fibroblasts;Collagenase;Trypsin

Q253

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.035

1000-4718(2014)02-0380-05

2013-09-05

2013-11-06

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2011040003614);廣東省科技計(jì)劃(No.B2011071)

△通訊作者Tel:020-87755766-8140;E-mail:dongxg@mail.sysu.edu.cn