劉益民， 王倩倩， 賀慧艷， 王 玉△

近年的研究表明，三叉神經(jīng)電刺激有明確的抗癲癇作用，其具體機制尚未見明確的研究報道［1-2］。我們的前期實驗研究表明，經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激(external trigeminal nerve electrostimulation，eTNS)預(yù)處理增加了戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)致癇大鼠海馬區(qū)谷氨酸脫羧酶的表達(dá)，進(jìn)而可能通過誘導(dǎo)腦內(nèi)抑制性機制的增強來實現(xiàn)抗癲癇作用［3］。諸多因素參與癲癇發(fā)生、發(fā)展過程［4-6］，越來越多的實驗和臨床研究表明炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)是癲癇的的重要病理機制［7-8］。有鑒于此，我們對大鼠進(jìn)行經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激，之后應(yīng)用PTZ點燃癲癇大鼠，觀察預(yù)處理對癲癇是否具有抑制作用以及對海馬致癇細(xì)胞因子的影響，為經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激在癲癇防治中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 動物與分組

選用成年健康雄性 SD大鼠，220～250 g，SPF級，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。置于安靜、避光、自由攝取食水的室溫環(huán)境下飼養(yǎng)2周，以適應(yīng)環(huán)境。動物隨機分為對照組(control組)、致癇組(PTZ組)和eTNS組，eTNS組動物給予PTZ點燃癲癇及7 d、14 d和28 d連續(xù)的經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激，PTZ組大鼠給予PTZ點燃癲癇及相同時間的0參數(shù)假刺激，而control組大鼠僅給予相同時間的0參數(shù)假刺激。

2 主要試劑

PTZ購自Sigma，兔抗大鼠白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)多克隆抗體購于 Abcam，ELISA 試劑盒購自Invitrogen，免疫組化II抗試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)公司。經(jīng)皮電刺激儀(KD-2A型，北京博洋生物器械公司)。

3 主要方法

3.1 經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激 實驗操作時動作輕柔，大鼠先腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉動物。經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激組:大鼠俯臥固定，將2個膜式電極對稱外置于眼眶上方約1 cm中內(nèi)1/3處的三叉神經(jīng)眼支分布區(qū)域，固定后外接經(jīng)皮電刺激儀。刺激參數(shù)［9］:頻率 140 Hz、電流 10 mA、脈寬 500 μs、正相脈沖刺激30 s，間歇5 min，每天連續(xù)刺激2 h。Control組和PTZ組大鼠亦被固定，外接刺激儀器，刺激參數(shù)均設(shè)置為0，持續(xù)2 h。各組操作均在8:00-12:00間進(jìn)行。

3.2 急性癇性痙攣模型的建立 各實驗動物于7 d、14 d和28 d經(jīng)皮電刺激或假刺激結(jié)束后分別給予PTZ(75 mg/kg)腹腔注射并觀察行為學(xué)變化。依據(jù)Rudge等［10］對大鼠癲癇發(fā)作時的行為描述來判斷動物是否癇性發(fā)作并進(jìn)行評分:0分:無任何反應(yīng);1分:面部痙攣，包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼等;2分:1分加節(jié)律性點頭;3分:出現(xiàn)單肢痙攣;4分:出現(xiàn)雙前肢痙攣，甩尾;5分:四肢或全身痙攣大發(fā)作，摔倒;6分:癲癇持續(xù)狀態(tài)，持續(xù)30 min以上的雙前肢痙攣或全身痙攣即可認(rèn)為是持續(xù)狀態(tài);7分:死亡。行為學(xué)觀察后24 h給予10%水合氯醛深度麻醉后(400 mg/kg，腹腔注射)取材，分別行免疫組化灌注固定取材及海馬組織提取兩部分。

3.3 免疫組化灌注取材及固定 大鼠麻醉滿意后，迅速開胸暴露心臟，用灌注穿刺針沿著心臟的縱軸方向經(jīng)心尖刺入左心室至升主動脈根部縫扎固定，在右心耳剪一小口，可見血液流出，先用0.9%氯化鈉注射液200 mL快速灌注以沖凈血液，待右心耳流出清亮液體時，再用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mmol/L PBS，pH 7.4)100 mL先快后慢灌注，灌注時間約15 min，灌注至大鼠四肢及尾巴伸直變硬時，斷頭取腦組織固定于4% 多聚甲醛中72 h，流水沖洗標(biāo)本18 h后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，取含背側(cè)海馬最大冠狀層面的腦組織作石蠟切片，片厚4 μm。

3.4 免疫組化法染色 切片常規(guī)脫蠟至水，抗原熱修復(fù)后依次加入3%過氧化氫 、10%山羊血清封閉液，之后分別加Ⅰ抗 IL-1β(1∶100)或 TNF-α(1∶200)，于4℃冰箱過夜孵育，滴加II抗工作液及辣根酶，DAB顯色清晰后沖洗，烤干后中性樹膠封片，陰性對照用PBS代替Ⅰ抗。

3.5 ELISA海馬組織提取及組織處理 各實驗動物于癲癇持續(xù)狀態(tài)后24 h，腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)深度麻醉后斷頭取腦，冰盤內(nèi)沿矢狀線直切成對半，兩側(cè)大腦半球的海馬組織被離斷，存于液氮罐中。

3.6 細(xì)胞因子ELISA定量測定 取出液氮罐中留置海馬組織，標(biāo)本保持低溫條件下，各標(biāo)本稱重后用固定倍數(shù)的生理鹽水稀釋，快速電動勻漿后移入離心管，4℃低溫離心20 min(3 000 r/min)。離心后取上清，分裝后1份待測，其余－80℃冰箱保存待用。ELISA法檢測各標(biāo)本內(nèi)IL-1β和TNF-α的含量，具體方法按說明書進(jìn)行。

3.7 免疫組化圖像采集 圖像采集在Olympus顯微攝像系統(tǒng)觀察陽性細(xì)胞的表達(dá)，切片置光學(xué)顯微鏡下，分別對每張切片的海馬各區(qū)進(jìn)行詳細(xì)觀察及攝片。同一指標(biāo)采用相同的曝光度，并以計算機提供的窗口為單位(×400)，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics)，隨機測定窗口區(qū)陽性細(xì)胞的平均光密度值。系統(tǒng)自動把測定區(qū)轉(zhuǎn)換為純白背景，陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)換為灰色，在系統(tǒng)進(jìn)行各指標(biāo)平均吸光測定時，參數(shù)保持不變。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。行為學(xué)分析時，組間癲癇持續(xù)時間的比較運用t檢驗，發(fā)作強度比較運用曼-惠特尼U檢驗。海馬細(xì)胞因子的定量比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)及 SNK-q檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 三叉神經(jīng)電刺激減輕PTZ點燃大鼠的發(fā)作程度

Control組大鼠表現(xiàn)正常，無癲癇發(fā)作癥狀。PTZ組和eTNS組動物在腹腔注入PTZ后2～5 min內(nèi)均出現(xiàn)癲癇大發(fā)作癥狀，如全身肌肉陣發(fā)性抽搐、強直性抽搐、尖叫、跳躍、甩尾等。15 min左右癥狀逐漸減輕，隨時間延長，抽搐幅度逐漸減小，持續(xù)約1～2 h完全緩解。三叉神經(jīng)刺激后28 d的動物癇性發(fā)作等級和發(fā)作時間較PTZ組明顯降低(P＜0.05)，見表1。

表1 急性驚厥大鼠的發(fā)作強度及持續(xù)時間Table 1.Severity and duration of acute seizure in rats(Mean±SD)

2 免疫組化半定量分析

Control組大鼠各時點IL-1β和TNF-α未見明顯陽性細(xì)胞的表達(dá)。從形態(tài)學(xué)觀察，IL-1β在膠質(zhì)細(xì)胞和少量散在神經(jīng)元中表達(dá)(圖1)，而TNF-α僅表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞中(圖2)。與control組比較，7 d PTZ組和eTNS組的IL-1β及TNF-α表達(dá)差異不顯著，14 d及28 d差異明顯(P＜0.01);與PTZ組比較，eTNS組IL-1β及TNF-α表達(dá)在7 d未見明顯差異，但在14 d及28 d，eTNS組IL-1β和TNF-α表達(dá)顯著減少(P ＜0.05)，見表2。

Figure 1.The expression of IL-1β at 14 d and 28 d after consecutive electrostimulation.圖1 連續(xù)電刺激14 d和28 d海馬CA1區(qū)IL-1β的表達(dá)

Figure 2.The expression of TNF-α at 14 d and 28 d after consecutive electrostimulation.圖2 連續(xù)電刺激14 d和28 d海馬CA1區(qū)TNF-α的表達(dá)

3 ELISA定量分析

Control組大鼠海馬IL-1β及TNF-α蛋白含量甚微;PTZ點燃后，與control組比較，各時點PTZ組和eTNS組的IL-1β及TNF-α蛋白含量增加明顯(P＜0.01)。與PTZ組比較，刺激后7 d，eTNS組的 IL-1β及TNF-α蛋白含量無明顯差異(P＞0.05);而刺激后14 d，eTNS組的IL-1β及TNF-α蛋白含量顯著減少(P ＜0.05);刺激后28 d，eTNS組的IL-1β 及 TNF-α蛋白含量減少更明顯(P＜0.01)，見圖3、4。

Figure 3.Comparison of the content of IL-1β in hippocampus at different time points among control group，PTZ group and eTNS group.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs PTZ group.圖3 不同時點control組、PTZ組和eTNS組間海馬IL-1β蛋白含量的比較

討 論

最新研究報道經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激這一技術(shù)在美國已初步應(yīng)用于臨床頑固性癲癇病人的治療探索，半數(shù)以上的頑固性癲癇發(fā)作得到顯著改善或完全控制發(fā)作［1］。經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激在操作方面簡便易行，無明顯的心血管不良事件發(fā)生［11］，在便利性和經(jīng)濟性方面明顯優(yōu)于腦深部電刺激、脊髓電刺激和迷走神經(jīng)電刺激，對其抗癲癇作用及具體機制的進(jìn)一步探索具有重要的理論和實踐意義。

Figure 4.Comparison of the content of TNF-α in hippocampus at different time points among control group，PTZ group and eTNS group.Mean ± SD.n=6.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs PTZ group.圖4 不同時點control組、PTZ組和eTNS組間海馬TNF-α蛋白含量的比較

既往的研究表明，癲癇與細(xì)胞因子密切相關(guān)，癲癇持續(xù)狀態(tài)導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)元選擇性死亡，同時引起海馬區(qū)炎癥細(xì)胞因子的改變［12］。目前認(rèn)為，促炎癥細(xì)胞因子IL-1β及其受體在癲癇形成中起到關(guān)鍵作用，IL-1β的產(chǎn)生促進(jìn)了癲癇的形成［7-8］。藥物研究明確證實抑制IL-1β生物合成減弱了小鼠的自發(fā)性發(fā)作［13］。實驗研究表明，TNF-α作為一種經(jīng)典的促炎癥細(xì)胞因子，能調(diào)整突觸的傳遞，尤其是膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNF-α，可以通過調(diào)整神經(jīng)元表面的α-氨基羥甲基惡唑丙酸受體，加快突觸的傳遞，并且通過與不同受體調(diào)整與谷氨酸能系統(tǒng)相互作用，調(diào)整神經(jīng)興奮性，進(jìn)而影響癲癇發(fā)生的敏感性［14-15］。

PTZ通過影響氯離子通道活性從而使神經(jīng)元過度興奮，引起癲癇發(fā)作。PTZ引起的慢性癲癇發(fā)作與人類的自發(fā)性癲癇較為類似，可引起與人類較為相似的行為和神經(jīng)病理的改變［16］。本研究經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激組較致癇組大鼠在行為學(xué)上的表現(xiàn)明顯減輕，并且刺激組動物海馬IL-1β和TNF-α蛋白的表達(dá)明顯減少，表明經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激減少致癇細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的合成與釋放，減弱中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，減輕致癇動物的腦損傷，進(jìn)而可能影響癲癇的形成。有關(guān)三叉神經(jīng)刺激與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥調(diào)節(jié)機制尚未明確，需進(jìn)一步探索，經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激可能為癲癇的防治提供新的思路。

［1］ DeGiorgio CM，Murray D，Markovic D，et al.Trigeminal nerve stimulation for epilepsy:long-term feasibility and efficacy［J］.Neurology，2009，72(10):936-938.

［2］ DeGiorgio CM，F(xiàn)anselow EE，Schrader LM，et al.Trigeminal nerve stimulation:seminal animal and human studies for epilepsy and depression［J］.Neurosurg Clin N Am，2011，22(4):449-456.

［3］ 張慧敏，李良勇，李家林，等.經(jīng)皮三叉神經(jīng)電刺激預(yù)處理對戊四氮致癇大鼠海馬谷氨酸脫羧酶表達(dá)的影響［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011，46(8):732-736.

［4］ 王勝軍，趙秀鶴，劉學(xué)伍，等.聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬組織凋亡誘導(dǎo)因子及炎癥因子的研究［J］.中國病理生理雜志，2012，28(2):258-262.

［5］ 王勝軍，遲兆富，王樹華，等PARP調(diào)節(jié)癲癇大鼠海馬核轉(zhuǎn)錄因子κB及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志，2010，26(1):86-90.

［6］ 彭毓棻，宋 治.NMDA受體在癲癇發(fā)病機制中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(6):1230-1233，1239.

［7］ Friedman A，Dingledine R.Molecular cascades that mediate the influence of inflammation on epilepsy［J］.Epilepsia，2011，52(Suppl 3):33-39.

［8］ Vezzani A，F(xiàn)rench J，Bartfai T，et al.The role of inflammation in epilepsy［J］.Nat Rev Neurol，2011，7(1):31-40.

［9］ Fanselow EE，Reid AP，Nicolelis MA.Reduction of pentylenetetrazole-induced seizure activity in awake rats by seizure-triggered trigeminal nerve stimulation［J］.J Neurosci，2000，20(21):8160-8168.

［10］ Rudge JS，Mather PE，Pasnikowski EM，et al.Endogenous BDNF protein is increased in adult rat hippocampus after a kainic acid induced excitotoxic insult but exogenous BDNF is not neuroprotective［J］.Exp Neurol，1998，149(2):398-410.

［11］ Pop J，Murray D，Markovic D，et al.Acute and long-term safety of external trigeminal nerve stimulation for drug-resistant epilepsy［J］.Epilepsy Behav，2011，22(3):574-576.

［12］ De Simoni MG，Perego C，Ravizza T，et al.Inflammatory cytokines and related genes are induced in the rat hippocampus by limbic status epilepticus［J］.Eur J Neurosci，2000，12(7):2623-2633.

［13］ Maroso M，Balosso S，Ravizza T，et al.Interleukin-1beta biosynthesis inhibition reduces acute seizures and drug resistant chronic epileptic activity in mice［J］.Neurotherapeutics，2011，8(2):304-315.

［14］ Balosso S，Ravizza T，Pierucci M，et al.Molecular and functional interactions between tumor necrosis factor-alpha receptors and the glutamatergic system in the mouse hippocampus:implications for seizure susceptibility［J］.Neuroscience，2009，161(1):293-300.

［15］ Stellwagen D，Beattie EC，Seo JY，et al.Differential regulation of AMPA receptor and GABA receptor trafficking by tumor necrosis factor-alpha［J］.J Neurosci，2005，25(12):3219-3228.

［16］ Qu H，Eloqayli H，Sonnewald U.Pentylenetetrazole affects metabolism of astrocytes in culture［J］.J Neurosci Res，2005，79(1-2):48-54.