楊 麗， 李 欣， 田 朗， 黃利華， 李卓穎， 楊作成

(中南大學湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410013)

柯薩奇病毒B3感染HeLa細胞后Bax和Bim的表達*

楊 麗， 李 欣， 田 朗， 黃利華， 李卓穎， 楊作成△

(中南大學湘雅三醫(yī)院兒科，湖南長沙 410013)

目的：觀察HeLa細胞感染柯薩奇病毒B3(CVB3)后Bax和Bim mRNA和蛋白的表達。方法：將HeLa細胞分為未予以CVB3感染的對照組和予以CVB3感染的病毒組，取3 h、6 h、9 h、12 h和24 h的細胞，采用RT-PCR和Western blotting分別檢測Bax和Bim mRNA和蛋白的表達。結果：Bax和Bim mRNA在對照組和病毒組HeLa細胞中均有表達，在病毒組和對照組中Bax和Bim mRNA的表達在各自組內均無顯著差異(P＞0.05)，但在24 h Bax和Bim在病毒組mRNA的表達低于對照組(P＜0.05)。Bax和Bim蛋白表達在對照組中各時點均有表達，但無顯著差異(P＞0.05)。病毒組Bax蛋白在24 h表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且病毒組表達明顯低于對照組(P＜0.05);Bim蛋白的表達隨感染時間延長而下降(P＜0.05)，9 h、12 h和24 h表達病毒組低于對照組(P＜0.05)。結論：Bax和Bim在CVB3感染誘導的HeLa細胞凋亡早期發(fā)揮作用。

HeLa細胞;柯薩奇病毒B3;細胞凋亡;Bax蛋白;Bim蛋白

引起病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的病毒眾多，而以柯薩奇病毒 B3(coxsackievirus B3，CVB3)引起的病毒性心肌炎較常見［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，VMC的發(fā)病與病毒感染所造成的直接損傷和感染后引起的機體免疫紊亂有關［3-4］。近年研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞的凋亡也參與了VMC的發(fā)生、發(fā)展［5-6］，認為細胞凋亡也是VMC的發(fā)病機制之一。參與細胞凋亡的信號通路及基因家族有多種，Bcl-2家族與細胞凋亡密切相關，它具有雙重效應，即具有促進凋亡的作用，也起到抗細胞凋亡的效應［7］，其中Bim和Bax屬于該家族促進細胞凋亡成員。本研究以CVB3感染Hela細胞后，觀察促凋亡成員Bax和Bim mRNA和蛋白表達及變化，探討促凋亡因子在細胞凋亡中是否發(fā)揮作用。

材料和方法

1 材料與試劑

人宮頸癌細胞株HeLa由中南大學湘雅醫(yī)學院腫瘤研究所惠贈。CVB3 Nancy株由本實驗室保存?zhèn)鞔?］。采用微量法測定其半數(shù)組織感染量(TCID50)。逆轉錄試劑盒由 Toyobo生產;Trizol總RNA抽提試劑盒及胰蛋白酶由Gibco生產;改良型RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清由Hyclone生產;PCR Master Mix及Marker I購自北京天根生化科技有限公司;引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;Bax和Bim蛋白多克隆抗體由Cell Signaling Technology生產;蛋白裂解液及聚丙烯酰胺凝膠試劑購自北京碧云天生化科技有限公司。

2 主要方法

2.1 實驗分組 以2×108/L的密度將HeLa細胞均勻地接種于6孔板中，予10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁處于對數(shù)生長期時，以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓過夜，隨機設立對照組和病毒組。

2.2 CVB3感染HeLa細胞模型的建立 根據(jù)Reed-Muench法計算病毒滴度，選取2×100 TCID50病毒濃度(2×10-2)接種細胞。將6孔板中培養(yǎng)的HeLa細胞按照上述實驗方法隨機設立對照組及病毒組。以無血清培養(yǎng)基漂洗2次，對照組加入1 mL含2%胎牛血清的病毒維持液，病毒組加入1 mL病毒液。將6孔板置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h之后棄去6孔板中所有液體，然后加入病毒維持液2 mL，分別于加入病毒后3 h、6 h、9 h、12 h和24 h觀察細胞病變效應及提取RNA和蛋白。

2.3 RT-PCR檢測CVB3感染后HeLa細胞中凋亡相關基因的表達 采用Trizol試劑盒提取CVB3感染后不同時點對照組與病毒組的總RNA，然后按照逆轉錄試劑盒說明書將mRNA逆轉錄為cDNA，進行PCR產物擴增。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.4 Western blotting檢測CVB3感染后HeLa細胞中凋亡相關蛋白的表達 用蛋白裂解液在冰上裂解CVB3感染后不同時點對照組與病毒組的HeLa細胞，獲取全細胞裂解液，檢測蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜，放入5%脫脂牛奶4℃冰箱封閉過夜，加Ⅰ抗置于勻速搖床孵育3 h后漂洗，然后加入脫脂牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，室溫反應2 h后漂洗，化學發(fā)光底物顯色，膠片曝光，掃描。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 CVB3感染HeLa細胞后Bax mRNA的表達

對照組內不同時點比較，Bax mRNA的表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);病毒組內不同時點比較，Bax mRNA的表達量也無顯著差異(P＞0.05);對照組與病毒組比較，在3 h、6 h、9 h和12 h各時點差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但病毒組24 h Bax mRNA表達低于對照組(P＜0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.The mRNA expression of Bax in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖1 不同時點病毒組與對照組HeLa細胞內Bax mRNA的表達

表2 不同時點CVB3感染HeLa細胞對Bax mRNA表達的影響Table 2.The relative mRNA expression levels of Bax in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean± SD.n=4)

2 CVB3感染HeLa細胞后Bax蛋白的表達

對照組內不同時點比較，Bax蛋白表達無顯著差異(P＞0.05);病毒組Bax蛋白在24 h表達降低，與各時點比較差異顯著(P＜0.05)，而3 h、6 h、9 h和12 h各時點比較無顯著差異(P＞0.05);對照組與病毒組間比較，3 h、6 h、9 h和12 h時點Bax蛋白表達均無顯著差異(P＞0.05)，但病毒組24 h的Bax蛋白表達低于對照組(P＜0.05)，見圖2、表3。

Figure 2.The protein expression of Bax in control group and CVB3-infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖2 不同時點CVB3感染HeLa細胞及對照組細胞內Bax蛋白的表達

表3 不同時點CVB3感染HeLa細胞對Bax蛋白表達的影響Table 3.The protein levels of Bax in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean±SD.n=3)

3CVB3感染HeLa細胞后Bim mRNA的表達

對照組內不同時點比較，Bim mRNA的表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);病毒組內不同時點比較，Bim mRNA的表達量差異也均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);對照組與病毒組間比較，3 h、6 h、9 h和12 h時點無顯著差異(P＞0.05)，但24 h時點病毒組Bim mRNA表達低于對照組(P＜0.05)，見圖3、表4。

Figure 3.The mRNA expression of Bim in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖3 不同時點病毒組與對照組HeLa細胞內Bim mRNA的表達

表4 不同時點CVB3感染HeLa細胞及對Bim mRNA表達的影響Table 4.The relative mRNA expression levels of Bim in CVB3-infected HeLa cells and control cells at different time points(Mean±SD.n=4)

4 CVB3感染HeLa細胞后Bim蛋白的表達

對照組內不同時點比較，Bim蛋白表達無顯著差異(P＞0.05);病毒組3 h與6 h、及9 h與12 h時點比較均無顯著差異(P＞0.05)，3 h和6 h Bim蛋白表達均較9 h、12 h和24 h高(均P＜0.05)，24 h的Bim蛋白表達較9 h和12 h明顯降低(P＜0.05);對照組與病毒組比較，3 h和6 h的Bim蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，在9 h、12 h和24 h Bim蛋白表達較對照組降低(P＜0.05)，尤以24 h時點下降明顯，見圖4、表5。

Figure 4.The protein expression of Bim in control group and CVB3 infection group at different time points.+:CVB3 infection group; -:control group.圖4 不同時點病毒組與對照組HeLa細胞內Bim蛋白的表達

表5 不同時點CVB3感染HeLa細胞對Bim蛋白表達的影響Table 5.The protein expression of Bim in CVB3-infected HeLa cells and the control cells at different time points(Mean±SD.n=3)

討論

VMC是由嗜心肌病毒感染引起的以局限性或彌散性心肌炎癥病變?yōu)橹鞯募膊?，是兒科臨床較常見的心血管疾病之一，近年來其發(fā)病率有所上升［9］。病毒感染不但可直接導致心肌細胞損傷，還可激活如Bcl-2家族、caspase家族等啟動心肌細胞凋亡，致心肌細胞損傷、心功能減退，并且心肌損傷程度和病毒毒力有關。細胞凋亡與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展有關［10］，在人類正常的心臟中可以出現(xiàn)細胞凋亡，而細胞凋亡的異常在心血管疾病的發(fā)病中也起著重要作用［11］，如心肌病、冠心病及高血壓病等。研究報道心肌炎患者心肌細胞中存在細胞凋亡異常，提示凋亡可能是心肌損害的機制之一。后來陸續(xù)證實細胞凋亡參與VMC的發(fā)生與發(fā)展［5，12-14］。

Bcl-2家族是與細胞凋亡密切相關的家族，在調控細胞凋亡的過程中發(fā)揮關鍵作用［15］，根據(jù)其作用機制可分為兩類:一類抗凋亡成員包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1等;另一類促凋亡成員包括Bax、Bad、Bim等［7］?？沟蛲雠c促凋亡成員協(xié)同作用，在凋亡過程中發(fā)揮開關效應。Bax是Bcl相關X蛋白，廣泛表達于心臟等各種組織中，過度表達可加速細胞凋亡。Bax不但有拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且可直接促進細胞凋亡。韓波等［16］發(fā)現(xiàn)CVB3感染心肌細胞后可使心肌細胞過量表達Bax，誘導心肌細胞凋亡。曾婭莉等［17］發(fā)現(xiàn)Bax mRNA表達在辛伐他汀干預K562細胞24 h后隨時間的延長其表達增高。本研究發(fā)現(xiàn)，CVB3感染HeLa細胞后Bax mRNA表達在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各時點均有表達，且24 h內Bax mRNA表達無增強或減弱的變化。同時通過觀察到CVB3感染HeLa細胞后Bax蛋白在各時點均有表達，在3 h、6 h、9 h和12 h Bax蛋白表達無明顯變化(P＞0.05)，至24 h蛋白表達明顯下降，與各時點比較有顯著差異(P＜0.05)。在病毒組Bax蛋白的表達中，12 h內Bax蛋白表達不隨時間的延長而變化，但在24 h蛋白表達明顯減弱，表明Bcl-2促凋亡成員Bax在病毒感染后的早期即促使細胞發(fā)生凋亡，但隨病毒感染時間的延長，促凋亡效應反而減弱，更證明Bcl-2家族凋亡成員的促凋亡作用在早期發(fā)揮作用。

Bim是一種與Bcl-2相互作用的僅含1個同源BH3結構域的促凋亡基因，其可直接激活BH3域被認為是細胞凋亡起始的必需因子，可通過抑制死亡因子或啟動促凋亡蛋白功能，導致細胞色素C自線粒體向細胞漿的釋放，啟動caspase，進而誘發(fā)細胞凋亡，也能以不依賴于細胞色素C的方式啟動caspase，如通過caspase啟動因子Apaf-1等來誘發(fā)細胞凋亡。曾有報道它可直接激活Bax和Bak，Bim缺失可觸發(fā)抗凋亡效應［18］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在CVB3病毒感染后Bim mRNA表達在3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各時點均有表達，且24 h內Bim mRNA表達無增強或減弱的變化，與Bax mRNA變化趨勢基本一致。在病毒感染后Bim蛋白在各時點均有表達，呈逐漸下降的趨勢，最初的3 h和6 h Bim蛋白表達無明顯差異，9 h至12 h開始出現(xiàn)蛋白表達下降，但9 h與12 h無差異，至24 h Bim蛋白表達明顯下降，且24 h與各時點比較均有顯著差異。李小平等［19］發(fā)現(xiàn)，CVB3感染HeLa細胞4 h后細胞發(fā)生凋亡，呈時間依賴性增高，24 h后較多HeLa細胞出現(xiàn)凋亡改變，但在晚期凋亡細胞中可能存在壞死的細胞，導致促凋亡基因及蛋白表達降低。本實驗發(fā)現(xiàn)，CVB3病毒感染HeLa細胞后Bax和Bim mRNA在24 h內各時點均有表達，但各時點間均無顯著差異(P＞0.05)。Bim蛋白表達在病毒感染早期較高，隨感染時間的延長出現(xiàn)逐漸下降趨勢，至24 h明顯下降，而Bax在12 h蛋白表達無顯著變化，至24 h明顯下降，可見Bax蛋白表達與Bim蛋白表達趨勢也基本一致，均是在24 h表達明顯減弱。

由此可知，在CVB3感染HeLa細胞模型中，Bcl-2家族促凋亡成員Bax和Bim均能發(fā)揮促凋亡作用，使HeLa細胞發(fā)生凋亡，且均在病毒感染早期就開始發(fā)揮促凋亡作用，該作用貫穿細胞死亡的始終，只是隨病毒感染時間的延長，因其它促使細胞死亡的形式可能逐漸超過細胞凋亡的作用，而導致促凋亡因子的表達反而隨時間的延長出現(xiàn)降低的現(xiàn)象，故提示促凋亡因子Bax和Bim在CVB3誘導的細胞凋亡中發(fā)揮作用。

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Expression of Bax and Bim in coxsackievirus B3-infected HeLa cells

YANG Li，LI Xin，TIAN Lang，HUANG Li-hua，LI Zhuo-ying，YANG Zuo-cheng
(Department of Pediatrics，Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha 410013，China.E-mail:yang_ zcr@126.com)

AIM:To observe the expression of Bax and Bim at mRNA and protein levels in coxsackievirus B3 (CVB3)-infected HeLa cells.METHODS:HeLa cells were divided into control(non-CVB3 infection)group and CVB3 infection group.The expression of Bim and Bax at mRNA and protein levels was determined by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blotting analysis at 3 h，6 h，9 h，12 h and 24 h postinfection.RESULTS:The mRNA expression of Bax and Bim in control group was not significantly different among different time points，so was that in CVB3 infection group(all P＞0.05).However，compared with control group，the mRNA expression of Bax and Bim in CVB3 infection groups was decreased at 24 h postinfection(all P＜0.05).The protein expression of Bax and Bim in control group was not significantly different among different time points(P＞0.05).However，in CVB3 infection group，the protein expression of Bax was lower at 24 h postinfection than that at 3 h(P＜0.05).Meanwhile，compared with control group，the protein expression of Bax in CVB3 infection group was decreased at 24 h postinfection(P＜0.05).The protein expression of Bim in CVB3 infection groups was decreased along with the time postinfection，and was decreased at 9 h，12 h and 24 h as compared with control group(P＜0.05).CONCLUSION:The proteins of Bax and Bim play an important role in CVB3-induced apoptosis of HeLa cells.

HeLa cells;Coxsackievirus B3;Apoptosis;Bax protein;Bim protein

R725

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.024

1000-4718(2014)03-0524-05

2013-03-04

2014-01-07

國家自然科學基金資助項目(No.30973233);中南大學創(chuàng)新課題資助項目(No.2011ssxt196)

△通訊作者Tel:0731-88618205;E-mail:yang_zcr@126.com