黃 煒， 徐 玲， 周雪琴， 徐 勇△

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州 646000;2成都市新都區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川成都 610500)

SUMO化修飾對高糖誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞IKKγ/NF-κB信號的影響*

黃 煒1，2， 徐 玲1， 周雪琴1， 徐 勇1△

(1瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川瀘州 646000;2成都市新都區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川成都 610500)

目的：探討小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)化修飾對高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞IκB激酶γ(IKKγ)/NF-κB信號的影響。方法：體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，設(shè)正常對照組、高糖干預(yù)組和滲透壓對照組:用免疫印跡和RT-PCR法檢測各組細(xì)胞SUMO1、SUMO2/3、IKKγ和NF-κB p65的表達(dá);用免疫共沉淀檢測SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用。結(jié)果：高糖呈濃度和時(shí)間依賴性上調(diào)系膜細(xì)胞SUMO和NF-κB p65表達(dá)(均P＜0.01)。各組細(xì)胞IKKγ的蛋白與mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05);高糖組SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用減弱(均P＜0.01)。結(jié)論：高糖影響IKKγ的SUMO化修飾，可能參與了高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞NF-κB信號激活的調(diào)控。

小泛素相關(guān)修飾物;IκB激酶γ;NF-κB;糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病特有而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，近年來的研究表明炎癥是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，核因子κB (NF-κB)是目前公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥信號的主要信號通路并且在DN發(fā)病過程中扮演著重要的角色。IκB激酶(IκB kinase，IKK)γ又名NEMO(NF-κB essential modulator)，分子量為48 kD，是IKK復(fù)合物的調(diào)節(jié)亞基，介導(dǎo)了NF-κB信號經(jīng)典途徑的激活。小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)修飾是與泛素化修飾類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與了NF-κB、TGF-β等信號通路的調(diào)控。SUMO化修飾是否通過影響NF-κB信號參與DN的發(fā)病尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究觀察不同濃度高糖刺激后大鼠腎系膜細(xì)胞SUMO(SUMO1、SUMO2/3)與IKKγ的表達(dá)，并探討在高糖誘導(dǎo)下腎系膜細(xì)胞SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用，為進(jìn)一步研究高糖條件下SUMO化修飾對NF-κB信號調(diào)控的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要材料

大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心);兔抗大鼠 SUMO1單克隆抗體(Abcam);兔抗大鼠 SUMO2/3多克隆抗體(Millipore);免抗大鼠IKKγ多克隆抗體(Santa Cruz);兔抗大鼠NF-κB p65單克隆抗體(CST);小鼠抗大鼠GAPDH抗體(碧云天生物)

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 HBZY-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的低糖DMEM中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分設(shè)(1)正常對照組(NC組):使用低糖(含葡萄糖5.6 mmol/L)培養(yǎng)基;(2)高糖干預(yù)組(HG1、HG2和HG3組):培養(yǎng)基含葡萄糖濃度分別為10、20和30 mmol/ L;(3)滲透壓對照組(OP組):培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖和24.4 mmol/L甘露醇。各組分別作用6 h、12 h和24 h后收獲細(xì)胞。

2.2 免疫印跡(Western blotting)法 取細(xì)胞加蛋白抽提液，加樣品電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加兔抗大鼠IKKγ多克隆抗體(1∶800)、兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(1∶800)、兔抗大鼠 SUMO2/3多克隆抗體(1∶600)、兔抗大鼠 NF-κB p65 單克隆抗體(1∶1 000)和小鼠抗大鼠 GAPDH單克隆抗體(1∶2 000)，4℃過夜，PBST洗膜后分別用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgGⅡ抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯影。以IKKγ、SUMO、NF-κB p65與GAPDH蛋白條帶平均吸光度值之比表示蛋白含量。

2.3 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) 將細(xì)胞隨機(jī)分為:正常對照組(NC)、20 mmol/L高糖組(HG2)、滲透壓對照組(OP)和正常IgG陰性對照組(IgG)，分別在含上述不同干預(yù)因素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。加入含蛋白酶體抑制劑的IP裂解液，定量加入兔抗大鼠IKKγ多克隆抗體、正常大鼠IgG抗體(IgG組)，4℃輪轉(zhuǎn)搖晃充分孵育。將蛋白-抗體復(fù)合物移入離心柱并加入含protein A/G瓊脂糖，密封輪轉(zhuǎn)孵育1 h;離心洗脫瓊脂糖，將免疫沉淀產(chǎn)物煮沸變性后行 Western blotting分析，用兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(1∶800)和兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗體(1∶600)孵育檢測SUMO蛋白與IKKγ蛋白間相互作用。

2.4 RT-PCR 總RNA提取試劑盒提取各組腎系膜細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA于PCR反應(yīng)管中擴(kuò)增，SUMO1上游引物5’-TATGGACAGGACAGCAG-3’，下游引物5’-CCATTCCCAGTTCTTTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為170 bp。SUMO2/3上游引物5’-GACGAGAAACCCAAGGA-3’，下游引物5’-CTGCCGTTCACAATAGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為140 bp;內(nèi)參照GAPDH上游引物5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’，下游引物5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為114 bp。IKKγ上游引物5’-CAGCCTATCACCACCTCTT-3’，下游引物5’-GCACTTGGGACAACAGA-3’，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，上樣2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，以IKKγ、SUMO1和SUMO2/3的灰度值除以GAPDH的灰度值分別得到各檢測指標(biāo)的相對灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 高糖上調(diào)系膜細(xì)胞SUMO表達(dá)

與NC組比較，高糖作用6 h、12 h和24 h后，各組系膜細(xì)胞SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達(dá)均增強(qiáng)(均P＜0.05)，見圖1A;其中30 mmol/L葡萄糖作用24 h后系膜細(xì)胞SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達(dá)增強(qiáng)達(dá)峰值。不同濃度高糖干預(yù)系膜細(xì)胞24 h后，與NC組比較，SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達(dá)量隨糖濃度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖1B;SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達(dá)量與OP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。以上結(jié)果提示高糖呈時(shí)間和濃度依賴性上調(diào)系膜細(xì)胞SUMO蛋白與mRNA表達(dá)。

2 高糖對系膜細(xì)胞IKKγ表達(dá)無明顯影響

與NC組比較，30 mmol/L葡萄糖作用6 h、12 h和24 h后，IKKγ蛋白和mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，作用時(shí)間延長至48 h和72 h后差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，見圖2A;各組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。與NC組比較，不同濃度高糖作用24 h后，IKKγ蛋白和mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，見圖2B。以上結(jié)果提示高糖刺激對系膜細(xì)胞IKKγ表達(dá)無明顯影響。

Figure 1.The expression of SUMO1 and SUMO2/3 at protein and mRNA levels in rat mesangial cells after 30 mmol/L glucose challenge for different time periods(A)and at different glucose concentrations(B)detected by Western boltting and RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs HG2 or HG3 group.圖1 Western boltting和RT-PCR檢測不同濃度和不同時(shí)間高糖作用系膜細(xì)胞后SUMO1、SUMO2/3蛋白及mRNA的表達(dá)

3 高糖減弱系膜細(xì)胞IKKγ的SUMO化修飾

免疫共沉淀結(jié)果顯示，用抗IKKγ抗體免疫沉淀IKKγ-未知蛋白復(fù)合物后，免疫印跡法電泳、轉(zhuǎn)膜、抗SUMO1和SUMO2/3抗體孵育，化學(xué)發(fā)光示在約80 kD處出現(xiàn)明顯的SUMO1-IKKγ(圖3A)和SUMO2/ 3-IKKγ(圖3B)結(jié)合條帶，在17 kD(SUMO1和SUMO2/3)處出現(xiàn)明顯的游離SUMO條帶;同時(shí)，正常IgG對照組在相應(yīng)蛋白分子位置未顯現(xiàn)蛋白條帶，提示免疫共沉淀結(jié)果可靠。進(jìn)一步比較NC組、HG2組、OP組及IgG對照組蛋白分子表達(dá)量，與NC組比較，HG2組與OP組蛋白分子表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05);HG2組與OP組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)，見圖3C、D。以上結(jié)果提示高糖可能誘導(dǎo)SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用減弱。

4 高糖激活NF-κB信號

與NC組比較，高糖干預(yù)24 h后，隨糖濃度提高，NF-κB p65蛋白表達(dá)逐步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，見圖4，提示高糖呈濃度依賴性增強(qiáng)腎系膜細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)。

Figure 2.The protein and mRNA expression of IKKγ in rat mesangial cells after 30 mmol/L glucose challenge for different time periods(A)and at different glucose concentrations(B)detected by Western boltting and RT-PCR.Mean±SD.n=3.圖2 Western boltting和RT-PCR檢測不同濃度和不同時(shí)間高糖作用系膜細(xì)胞后IKKγ蛋白及mRNA的表達(dá)

Figure 3.SUMOylation of IKKγ in rat mesangial cells after high-glucose challenge detected by co-immunoprecipitation.A:SUMO1 interacted with IKKγ;B:SUMO2/3 interacted with IKKγ;C:interaction between SUMO1 and IKKγ in different groups;D: interaction between SUMO2/3 and IKKγ in different groups.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖3 免疫共沉淀檢測高糖作用系膜細(xì)胞后對IKKγ SUMO化修飾的影響

Figure 4.The expression of NF-κB p65 protein in rat mesangial cells after high-glucose challenge at different glucose concentrations detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖4 Western blotting檢測不同濃度高糖作用系膜細(xì)胞后NF-κB p65蛋白的表達(dá)

討論

與泛素化介導(dǎo)的蛋白降解不同，SUMO化修飾是通過蛋白-蛋白相互作用而賦予靶蛋白新的生物特性，在加強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程中都發(fā)揮了廣泛而重要的作用［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，正常糖濃度組大鼠系膜細(xì)胞SUMO表達(dá)被抑制在很低的水平，伴隨著糖濃度的提高，SUMO表達(dá)逐漸增強(qiáng)。本研究結(jié)果與大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓形成過程中SUMO表達(dá)增強(qiáng)的結(jié)果類似［2］，于是推測SUMO蛋白可能作為一種細(xì)胞應(yīng)激蛋白，參與多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的翻譯后修飾，從多種層面動(dòng)態(tài)地影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，可能參與包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種疾病的病理生理改變。

IKK是一個(gè)多亞基催化酶，是NF-κB信號與上游刺激因子(LPS、胰島素等)的聯(lián)系樞紐，包括催化亞基IKKα、IKKβ以及調(diào)節(jié)亞基IKKγ。活化的IKK使IκBα蛋白2個(gè)絲氨酸殘基(S32、S36)磷酸化，繼而發(fā)生泛素化降解，NF-κB活化轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)炎癥相關(guān)基因(如IL-6)的轉(zhuǎn)錄和翻譯［3］。

雖然IKK復(fù)合物的催化作用依賴于2個(gè)催化亞基，但是近年的研究表明［4］，調(diào)節(jié)亞基IKKγ結(jié)構(gòu)的完整性對IKK復(fù)合物的活性及下游NF-κB的激活起到重要作用，如單獨(dú)過表達(dá)IKKγ二聚體和IKK相互作用基序都能激活I(lǐng)KK，但是在全長的IKKγ缺失時(shí)這2種過表達(dá)狀態(tài)對IKK的激活都比較弱;并且，IKKγ涉及的蛋白間相互作用可能影響多種信號通路功能的發(fā)揮。本研究表明，高糖刺激對腎系膜細(xì)胞IKKγ mRNA與蛋白表達(dá)無明顯影響，推測IKKγ表達(dá)有相對穩(wěn)定性，其本身不參與催化NF-κB信號的活化。

作為調(diào)節(jié)亞基，IKKγ在NF-κB途徑中被視為一種支架蛋白，可能與多種分子相互作用，如在TNF刺激下，IKKγ對接頭蛋白RIP1的募集對于IKK和NF-κB活性起到重要作用。最近的研究顯示，IKKγ可被SUMO修飾，修飾位點(diǎn)在K277和K309這2個(gè)賴氨酸殘基上，參與了DNA損傷誘導(dǎo)的NF-κB信號活化［5］。另有研究發(fā)現(xiàn)，SUMO化酶PIASy可誘導(dǎo)并促進(jìn)SUMO與IKKγ共價(jià)結(jié)合，活化IKK復(fù)合物，使NF-κB信號放大，抗氧化劑能逆轉(zhuǎn)DNA損傷誘導(dǎo)的IKKγ SUMO化修飾［6］。到目前為止只發(fā)現(xiàn)了IKKγ特異性的SUMO1修飾，而SUMO2/3能否修飾IKKγ迄今未見報(bào)道。本研究證明，正常條件下SUMO1和SUMO2/3均可修飾IKKγ，高糖刺激減弱SUMO1和SUMO2/3與IKKγ的相互作用(即SUMO化)，推測這可能是高糖影響IKK下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活NF-κB信號，參與糖尿病腎病發(fā)病的又一可能機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明SUMO化修飾可能參與了高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞IKKγ/NF-κB信號的激活，其作用機(jī)制可能與高糖減弱SUMO與IKKγ的相互作用、改變IKK復(fù)合物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及上調(diào)NF-κB p65表達(dá)有關(guān)。

［1］ 郭武華，張吉祥.SUMO修飾與端粒維持［J］.中國病理生理雜志，2009，25(10):2058-2061.

［2］田 華，戴愛國，符代炎，等.小泛素蛋白樣修飾蛋白1在大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中的作用［J］.中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2010，9(1):48-52.

［3］Shibata Y，Inoue J.A novel NF-kappaB regulatory mechanism targeting a polyubiquitin chain［J］.Seikagaku，2013，85(6):405-413.

［4］Shifera AS.Protein-protein interactions involving IKKgamma(NEMO)that promote the activation of NF-kappaB［J］.J Cell Physiol，2010，223(3):558-561.

［5］Kfoury Y，Setterblad N，El-Sabban M，et al.Tax ubiquitylation and SUMOylation control the dynamic shuttling of Tax and NEMO between Ubc9 nuclear bodies and the centrosome［J］.Blood，2011，117(1):190-199.

［6］Mabb AM，Wuerzberger-Davis SM，Miyamoto S.PIASy mediates NEMO SUMOylation and NF-kappaB activation in response to genotoxic stress［J］.Nat Cell Biol，2006，8 (9):986-993.

Effects of SUMOylation on IKKγ/NF-κB signaling in cultured rat glomerular mesangial cells treated with high glucose

HUANG Wei1，2，XU Ling1，ZHOU Xue-qin1，XU Yong1
(1Department of Endocrinology，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China;2Department of Endocrinology，People’s Hospital of Xindu District，Chengdu 610500，China.E-mail:xywyll@aliyun.com)

AIM:To investigate the effects of SUMOylation on IκB kinase γ(IKKγ)/NF-κB signaling in cultured rat glomerular mesangial cells(GMCs)treated with high glucose.METHODS:Cultured HBZY-1 rat GMCs were divided into normal glucose group and high glucose groups，and mannitol was used for osmotic control.The expression of SUMO1，SUMO2/3，IKKγ and NF-κB p65 was measured by Western blotting and RT-PCR.Interaction between SUMO and IKKγ was detected by co-immunoprecipitation.RESULTS:Compared with normal glucose group，the expression of SUMO and NF-κB p65 was increased in high glucose groups in a dose-and time-dependent manner.The expression of IKKγ was not changed by high glucose.The SUMOylation of IKKγ in high glucose groups was significantly decreased as compared with normal glucose group.CONCLUSION:High glucose obviously changes the interaction between SUMO and IKKγ in cultured rat mesangial cells，which may be involved in the activation of NF-κB by taking a special influence on the SUMOylation of IKKγ/NF-κB signaling molecules.

Small ubiquitin-related modifier;I-kappa B kinase gamma;NF-kappa B;Diabetic nephropathies

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.027

1000-4718(2014)03-0538-05

2013-10-25

2013-01-15

四川省教育廳科研項(xiàng)目(No.11ZB223)

△通訊作者Tel:0830-3161546;E-mail:xywyll@aliyun.com