尹麗琴， 許銘炎， 陳錫和， 舒申友， 傅玉才， 鄧小玲

(1廈門市口腔醫(yī)院，福建廈門 361009;2汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515041;3廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建廈門 361102)

轉(zhuǎn)錄因子YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6基因表達(dá)的影響*

尹麗琴1，2， 許銘炎1△， 陳錫和2， 舒申友2， 傅玉才2， 鄧小玲3△

(1廈門市口腔醫(yī)院，福建廈門 361009;2汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515041;3廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建廈門 361102)

目的：研究腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞整合素β6(integrin β6，ITGB6)基因表達(dá)調(diào)控的影響。方法：用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分布在ITGB6啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子YY1潛在的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，利用雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)ITGB6啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)錄活性;利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)在天然染色質(zhì)條件下轉(zhuǎn)錄因子YY1與ITGB6啟動(dòng)子的結(jié)合情況;采用定點(diǎn)突變方法檢測(cè)YY1結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ITGB6啟動(dòng)子活性的影響;利用RT-PCR方法檢測(cè)過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6 mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果：ITGB6啟動(dòng)子-421～-150 nt區(qū)域存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子YY1潛在的結(jié)合位點(diǎn)。在口腔鱗癌細(xì)胞的天然染色質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合于ITGB6啟動(dòng)子-421～-150 nt區(qū)域;定點(diǎn)突變YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6啟動(dòng)子活性無顯著影響。另外，過表達(dá)的YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6 mRNA的表達(dá)水平也無影響。結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子YY1在口腔鱗癌細(xì)胞中結(jié)合于ITGB6基因啟動(dòng)子-421～-150 nt區(qū)域，但對(duì)ITGB6基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平無影響。

YY1轉(zhuǎn)錄因子;整合素β6;口腔腫瘤

整合素是一種位于細(xì)胞表面、由α亞基和β亞基組成的跨膜異二聚體，介導(dǎo)細(xì)胞間和細(xì)胞與胞外基質(zhì)間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中由β6(integrin β6，ITGB6)亞單位和αv亞單位組成的整合素αvβ6只特異性在上皮組織中表達(dá)，不僅參與創(chuàng)傷愈合和炎癥反應(yīng)時(shí)上皮組織重塑，而且與包括口腔鱗癌在內(nèi)的多種惡性上皮源性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1-3］。整合素αvβ6在口腔鱗癌組織樣本中過度表達(dá)并位于侵襲組織的邊緣［4］，但正常口腔黏膜組織幾無表達(dá)，提示高表達(dá)的αvβ6參與口腔鱗癌的進(jìn)展，但調(diào)控其過度表達(dá)的具體機(jī)制未知。由于ITGB6亞單位只與αv亞單位組成整合素αvβ6，因此ITGB6是控制整個(gè)異二聚體αvβ6表達(dá)的關(guān)鍵性亞單位。有報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子Ets-1［5］、STAT3［6］、Smad和AP-1［7］參與不同種類細(xì)胞中ITGB6過度轉(zhuǎn)錄，然而，其它與腫瘤侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控ITGB6的表達(dá)尚未見報(bào)道。

轉(zhuǎn)錄因子YY1是鋅指類轉(zhuǎn)錄因子Gli-Kruppel家族中的一員，也是polycomb group(PcG)蛋白家族中的一員，作為調(diào)控因子在多種組織中廣泛表達(dá)，參與染色質(zhì)重塑、胚胎形成、細(xì)胞組織分化及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程［8］。鑒于整合素αvβ6和YY1均參與腫瘤的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，本研究以口腔鱗癌細(xì)胞為細(xì)胞模型，探討YY1對(duì)整合素αvβ6關(guān)鍵性亞單位ITGB6轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞

人胚胎腎細(xì)胞株293T購(gòu)買于武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心，口腔鱗癌細(xì)胞株SAS由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)鄭金華教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑

高糖DMEM購(gòu)自Invitrogen;胎牛血清購(gòu)自Gibco;YY1、STAT3和β-actin抗體購(gòu)于Santa Cruz?；蚪MDNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和總RNA提取試劑盒及RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化有限公司;感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)、T4連接酶、KpnⅠ內(nèi)切酶、XhoⅠ內(nèi)切酶、pGL2-Basi載體和雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega;pCMV-YY1由哈佛大學(xué)SHI Yang教授惠贈(zèng);轉(zhuǎn)染試劑METAFECTENE? EASY購(gòu)自Biontex;細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning;引物合成及測(cè)序由北京六合華大基因有限公司完成。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 口腔鱗癌細(xì)胞SAS和293T細(xì)胞株均在5%CO2和37℃ 條件下，用含有10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3.2 ITGB6基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析 利用NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)查找ITGB6基因序列(Ref-Seq:NC_000002.11/161056571…161057199)，使用McPromoter及NNPP軟件進(jìn)行啟動(dòng)子預(yù)測(cè)，TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)分析轉(zhuǎn)錄因子YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)，確定ITGB6基因啟動(dòng)子片段區(qū)域。

3.3 ITGB6啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建提取口腔鱗癌細(xì)胞基因組DNA為模板，由ITGB6 -421F/ITGB6+208R、ITGB6-150F/ITGB6+208R和ITGB6(-421/-150)F/ITGB6(-421/-150)R分別組成3對(duì)引物(表1)擴(kuò)增ITGB6 5＇側(cè)翼區(qū)，PCR反應(yīng)條件:94℃ 5 min，95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 1 min，33個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物和PGL2-Basic載體共同經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，凝膠回收，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化的菌液涂板于氨芐青霉素抗性的LB平板上，培養(yǎng)篩選重組子。挑取陽性菌抽提質(zhì)粒，雙酶切，進(jìn)行PCR，測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒分別命名為pGL2-B6(-421/+208)、pGL2-B6(-150/ +208)和pGL2-B6(-421/-150)。

3.4 ITGB6-421～-150 nt區(qū)域點(diǎn)突變報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 首先利用上游引物引進(jìn)突變位點(diǎn)方法構(gòu)建YY1(1)和YY1(2)這2個(gè)位點(diǎn)的突變質(zhì)粒:以質(zhì)粒pGL2-B6(-421/-150)為模板，Mut YY1-1和 Mut YY1-2分別為上游引物、ITGB6(-421/-150)R為下游引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后克隆入pGL2-Basic載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL2-B6-M-YY1 (1)和pGL2-B6-M-YY1(2)。其余3個(gè)位點(diǎn)的突變則使用重疊延伸法［9］構(gòu)建:分別用 ITGB6(-421/ -150)F/Mut YY1-3R、ITGB6(-421/-150)F/Mut YY1 -4R、ITGB6(-421/-150)F/MutYY1-5R、ITGB6 (-421/-150)F/MutYY1-6R、MutYY1-3F/ITGB6 (-421/-150)R、Mut YY1-4F/ITGB6(-421/-150)R、Mut YY1-5F/ITGB6(-421/-150)R和 Mut YY1-6F/ ITGB6(-421/-150)R等引物進(jìn)行PCR反應(yīng)引入YY1突變位點(diǎn)，反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物切膠回收并將相同突變位點(diǎn)的產(chǎn)物等量混合作為第2次PCR反應(yīng)的模板，以ITGB6(-421/-150)F/ITGB6(-421/-150)R為引物，擴(kuò)增出YY1位點(diǎn)的突變片段，經(jīng)KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切后克隆入pGL2-Basic載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL2-B6-M-YY1(3)、pGL2-B6-M-YY1(4)、pGL2-B6-M-YY1 (5)和pGL2-B6-M-YY1(6)。PCR反應(yīng)所用引物序列見表1。

表1 構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒的引物序列Table 1.Primers for generating promoter reporter constructs

3.5 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以及雙螢光素酶活性檢測(cè) 按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸浮液(5× 109cells/L)種于孔板。另外，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，每孔質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑按1∶3比例用10 μL 1×EASY buffer稀釋，輕輕混勻，室溫孵育15 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴滴入孔板中，每次試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。48 h后，提取蛋白，或者裂解細(xì)胞，按照雙螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Dual-Glo?Luciferase Assay System)操作手冊(cè)進(jìn)行熒光檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)間為10 s，重組質(zhì)粒相對(duì)表達(dá)活性以螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性的比值來表示。

3.6 染色質(zhì)免疫共沉淀［10］SAS細(xì)胞經(jīng)胰酶消化離心后，用1%甲醛PBS交聯(lián)固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物8 min，1.25 mol/L甘氨酸終止交聯(lián)5 min，2 800 r/ min 4℃離心10 min，PBS洗脫2次;加裂解液冰上裂解5 min，然后超聲破碎(功率200 W，超聲時(shí)間10 s，次數(shù)10次，間隔30 s)，將其隨機(jī)打斷為200～500 bp的染色質(zhì)小片段;之后，染色質(zhì)與YY1、STAT3特異性抗體及磁珠4℃回旋(35 r/min)過夜，RIPA磁鐵上洗脫3遍，68℃水浴2 h，苯酚氯仿抽提法提富集的DNA，PCR特異的擴(kuò)增ITGB6啟動(dòng)子-289/ -150 bp區(qū)域，擴(kuò)增條件:94℃ 4 min，94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，30個(gè)循環(huán)。引物序列ITGB6(-289/-150)F:5’-TTCCTCATATATAGCCTATA-3’;ITGB6(-289/-150)R:5’-TAGAGAAAGTTAATATCTTTA-3’。

3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 SAS細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次，加入 RIPA(以 1∶100的比例加入 PMSF 100 nmol/L)裂解液，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，冰上裂解30 min，每隔10 min振蕩1次，之后用1 mL針頭抽吸10～20次，12 000 r/min 4℃ 離心15 min，吸取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度。蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，YY1和β-actin抗體以1∶3 000的比例4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，Ⅱ抗室溫1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，ECL發(fā)光液顯影。

3.8 總RNA提取和RT-PCR反應(yīng) SAS細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按總 RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA，用紫外吸收法測(cè)定RNA溶液濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明把RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ITGB6上游引物序列為5＇-GCAAGCTGCTGTGTGTAAGGA-3＇，下游引物序列為5＇-CTTGGGTTACAGCGAAGATCAA-3＇;β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-M)上游引物序列為5＇-AATCCAAATGCGGCATCT-3＇，下游引物序列為5＇-GAGTATGCCTGCCGTGTG-3＇。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0軟件對(duì)每種細(xì)胞內(nèi)每個(gè)片段的活性分別與組內(nèi)相鄰的組進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ITGB6基因啟動(dòng)子序列分析及啟動(dòng)子活性鑒定

通過生物信息學(xué)方法分析，發(fā)現(xiàn)ITGB6基因啟動(dòng)子近端(-421～+1)區(qū)域有6個(gè)YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖 1A;轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為 +1，結(jié)合基序: TATTT)。根據(jù)YY1潛在位點(diǎn)的分布，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL2-B6(-421/+208)和pGL2-B6(-150/+208)，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測(cè)相對(duì)螢光素酶活性，結(jié)果顯示(圖1B)當(dāng)ITGB6啟動(dòng)片段從-421截短到-150時(shí)，啟動(dòng)子活性顯著下降，提示YY1潛在的結(jié)合位點(diǎn)可能參與ITGB6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

Figure 1.The sequence analysis of ITGB6 promoter and relative luciferase activity of the constructs.A:prediction of the potential YY1 binding sites in ITGB6 promoter;B:relative luciferase activity of the constructs.*P＜0.05 vs pGL2-B6(-421/+208).圖1 ITGB6基因啟動(dòng)子序列分析及活性鑒定

2 口腔鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合于ITGB6基因啟動(dòng)子-289～-150 nt區(qū)域

為了驗(yàn)證口腔鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子YY1是否結(jié)合于 ITGB6基因的啟動(dòng)子區(qū)，分別使用 YY1和 STAT3(陽性對(duì)照)抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，用-289～-150 nt區(qū)域特異引物PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，在口腔鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合于ITGB6基因啟動(dòng)子-289～-150 nt區(qū)域。

Figure 2.Chromatin immunoprecipitation assay for YY1 binding to the-421～-150 nt region of ITGB6 promoter.圖2 染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)YY1與ITGB6基因啟動(dòng)子區(qū)-421～-150 nt體內(nèi)結(jié)合情況

3 定點(diǎn)突變分析YY1結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ITGB6基因啟動(dòng)子活性的影響

為了檢驗(yàn)ITGB6啟動(dòng)子區(qū)中YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ITGB6基因啟動(dòng)子活性的影響，我們構(gòu)建了6個(gè)定點(diǎn)突變質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，檢測(cè)突變YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ITGB6基因啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ITGB6啟動(dòng)子區(qū)6個(gè)YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)的逐個(gè)突變對(duì)相對(duì)螢光素酶活性沒有顯著影響，提示ITGB6基因-421～-150 nt區(qū)域啟動(dòng)子活性并非依賴于該區(qū)域中單個(gè)YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

Figure 3.The effect of YY1 binding site mutants on ITGB6 transcriptional activity.圖3 YY1結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)ITGB6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響

4 轉(zhuǎn)錄因子 YY1過表達(dá)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6 mRNA表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步探討YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6表達(dá)的影響，將YY1表達(dá)載體pCMV-YY1和空載體pCMV，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到口腔鱗癌細(xì)胞SAS中，48 h后，提取總蛋白，Western blotting法檢測(cè)YY1在SAS細(xì)胞中過表達(dá)(圖4A)。同樣方法轉(zhuǎn)染SAS細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示，過度表達(dá)的YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6 mRNA表達(dá)水平無顯著影響(圖4B)。

討論

Figure 4.The effects of YY1 over-expression on ITGB6 mRNA expression.A:YY1 over-expression in SAS cells;B: ITGB6 mRNA expression in SAS cells.Lane 1:control;Lane 2:pCMV;Lane 3:pCMV-YY1.圖4YY1過表達(dá)對(duì)ITGB6 mRNA水平的影響

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種常見的實(shí)體腫瘤，占所有惡性腫瘤的4%。在全世界范圍內(nèi)，每年都有超過10萬人死于OSCC。有研究顯示:口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病呈年輕化上升趨勢(shì)［11］。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的主要原因，因此，探討與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合素β6基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控的“開關(guān)”，決定基因的活動(dòng)。本研究利用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)及生物信息學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)ITGB6啟動(dòng)子區(qū)-421～+1之間有6個(gè)YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子YY1可結(jié)合于ITGB6啟動(dòng)子-421～-150 nt區(qū)域，提示YY1可能參與口腔鱗癌細(xì)胞ITGB6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。接著，我們對(duì)ITGB6啟動(dòng)子區(qū)-421～-150 nt區(qū)域中YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)YY1潛在結(jié)合位點(diǎn)的突變對(duì)報(bào)告基因表達(dá)活性無顯著影響，進(jìn)一步在口腔鱗癌細(xì)胞中過表達(dá) YY1，也未檢測(cè)到ITGB6 mRNA表達(dá)水平的變化，所有結(jié)果提示轉(zhuǎn)錄因子YY1并不參與ITGB6基因的基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控。有報(bào)道，轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在基因啟動(dòng)子區(qū)參與組成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，但是不參與基因轉(zhuǎn)錄激活［12］，因此可以推測(cè)，轉(zhuǎn)錄因子YY1可能參與ITGB6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物的形成，但是不參與ITGB6基因基本轉(zhuǎn)錄的激活。

此外，我們的研究是在基礎(chǔ)情況下進(jìn)行的，在其它誘導(dǎo)劑及細(xì)胞因子等影響下，轉(zhuǎn)錄因子YY1對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6表達(dá)調(diào)控是否有影響，有待進(jìn)一步研究。

［1］Bandyopadhyay A，Raghavan S.Defining the role of integrin αvβ6 in cancer［J］.Curr Drug Targets，2009，10 (7):645-652.

［2］許銘炎，鄧小玲，陳錫和，等.溶血磷脂酸對(duì)上皮細(xì)胞整合素β6表達(dá)的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(3):488-491.

［3］陳錫和，鄧小玲，尹麗琴，等.口腔鱗癌細(xì)胞中ITGB6基因主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的定位分析［J］.癌變·畸變· 突變，2013，25(3):190-193.

［4］Li HX，Zheng JH，F(xiàn)an HX，et al.Expression of αvβ6 integrin and collagen fibre in oral squamous cell carcinoma: association with clinical outcomes and prognostic implications［J］.J Oral Pathol Med，2013，42(7):547-556.

［5］Bates RC，Bellovin DI，Brown C，et al.Transcriptional activation of integrin β6 during the epithelial-mesenchymal transition defines a novel prognostic indicator of aggressive colon carcinoma［J］.J Clin Invest，2005，115(2):339-347.

［6］Azare J，Leslie K，Al-Ahmadie H，et al.Constitutively activated Stat3 induces tumorigenesis and enhances cell motility of prostate epithelial cells through integrin β6［J］.Mol Cell Biol，2007，27(12):4444-4453.

［7］Sullivan BP，Kassel KM，Manley S，et al.Regulation of transforming growth factor-β1-dependent integrin β6 expression by p38 mitogen-activated protein kinase in bile duct epithelial cells［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，337(2):471-478.

［8］Zhang Q，Stovall DB，Inoue K，et al.The oncogenic role of Yin Yang 1［J］.Crit Rev Oncog，2011，16(3-4):163-197.

［9］黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.第3版.北京:科學(xué)出版社，2002:1109-1113.

［10］Dahl JA，Collas P.A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay(ChIP)［J］.Nat Protoc，2008，3(6): 1032-1045.

［11］Zygogianni AG，Kyrgias G，Karakitsos P，et al.Oral squamous cell cancer:early detection and the role of alcohol and smoking［J］.Head Neck Oncol，2011，3:2.

［12］Pfau JD，Taylor RK.Mutations in toxR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter［J］.J Bacteriol，1998，180 (17):

4724-4733.

Role of transcription factor YY1 in regulation of ITGB6 gene expression in oral squamous cell carcinoma

YIN Li-qin1，2，XU Ming-yan1，CHEN Xi-he2，SHU Shen-you2，F(xiàn)U Yu-cai2，DENG Xiaoling3
(1Xiamen Stomatological Hospital，Xiamen 361009，China;2Laboratory of Cellular Senescence，Shantou University Medical College，Shantou 515041，China;3Department of Basic Medicine，Xiamen University Medical College，Xiamen 361102，China.E-mail:myxu1972@yahoo.com;caseydxl@yahoo.com)

AIM:To explore the role of transcription factor YY1 in the regulation of integrin β6(ITGB6)gene expression in oral squamous cell carcinoma.METHODS:The distribution of the potential YY1 binding sites in ITGB6 promoter were predicted by bioinformatic methods.Series of 5＇deletion of ITGB6 promoter luciferase reporter constructs containing potential YY1 binding sites were made and transfected into 293T cell line to detect the promoter activity.The binding activity of the transcription factor YY1 to ITGB6 promoter in the native chromatin environment was determined by chromatin immunoprecipitation(ChIP)assay.The role of the potential YY1 binding sites in the regulation of ITGB6 promoter activity was analyzed by substitution mutant analysis.The effect of YY1 over-expression on the mRNA expression of ITGB6 in oral squamous cell carcinoma cell line was measured by RT-PCR.RESULTS:Bioinformatics analysis revealed that there were several potential binding sites for YY1 in the region of-421～-150 nt in the ITGB6 promoter.ChIP assay showed that transcription factor YY1 bound to the ITGB6 promoter region of-421～-150 nt in the native chromatin environment.Substitution mutant analysis of potential YY1 binding sites in ITGB6 promoter did not affect the promoter activity of ITGB6.The over-expression of YY1 in oral squamous cell carcinoma cells did not affect the ITGB6 mRNA expression.CONCLUSION:The transcription factor YY1 binds to the region of-421～-150 nt in the ITGB6 promoter.However，it is not involved in the basic transcriptional regulation of ITGB6 gene in oral squamous cell carcinoma cells.

YY1 transcription factor;Integrin β6;Mouth neoplasms

R394.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.002

1000-4718(2014)03-0394-06

2013-10-16

2014-01-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30900661;No.81072208;No.81370160);教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目;汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與臨床科研基金資助項(xiàng)目

△通訊作者Tel:0592-2678587;E-mail:許銘炎myxu1972@yahoo.com;鄧小玲E-mail:caseydxl@yahoo.com