邊佳明,張梅

(北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科,北京 100700)

嗎啡對(duì)μ阿片受體介導(dǎo)的ERK磷酸化的影響

邊佳明,張梅

(北京軍區(qū)總醫(yī)院藥理科,北京 100700)

目的 利用表達(dá)μ阿片受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞,研究嗎啡急慢性處理下對(duì)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化的影響。方法免疫印跡檢測(cè)磷酸化ERK水平,獲取1 h急性處理的ERK磷酸化變化時(shí)程和36 h慢性處理以及納洛酮催促下的ERK磷酸化變化。結(jié)果1 μmol·L-1嗎啡可以快速誘導(dǎo)ERK磷酸化水平短暫升高,5 min時(shí)達(dá)峰(P＜0.01),嗎啡誘導(dǎo)的ERK磷酸化水平升高具有顯著的濃度依賴性。10 μmol·L-1嗎啡慢性處理36 h后ERK磷酸化水平與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但納洛酮急性催促5或10 min均導(dǎo)致ERK磷酸化顯著下降(與對(duì)照比較,P＜0.01)。結(jié)論嗎啡急慢性刺激下以及納洛酮催促下ERK磷酸化表現(xiàn)出不同的變化形式,提示μ阿片受體介導(dǎo)下ERK相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生了代償。

嗎啡;μ阿片受體;卵巢細(xì)胞;細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶;磷酸化

阿片受體是典型的G蛋白耦聯(lián)受體,通過(guò)耦聯(lián)Gi/o蛋白,激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ(ACⅠ、Ⅴ、Ⅵ),從而抑制環(huán)單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號(hào)通路[1]。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在廣泛的對(duì)話(cross talk)機(jī)制,研究不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路間的對(duì)話對(duì)了解信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)十分有意義。酪氨酸激酶受體激活的有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是細(xì)胞內(nèi)另一條極其重要的信號(hào)通路,其家族中Raf-MEK-ERK級(jí)聯(lián)通路與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、存活密切相關(guān)[2]。筆者利用表達(dá)外源性μ阿片受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞,研究嗎啡急慢性處理下細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase,ERK)磷酸化的變化,以期了解嗎啡刺激下μ阿片受體介導(dǎo)的ERK磷酸化的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料 硫酸嗎啡,購(gòu)自青海制藥公司(批號(hào): 040618,純度:99%);鹽酸納洛酮(批號(hào):1028107,純度:99%)、苯甲基磺酰氟(phenylmethyl sulfonylfluoride,PMSF,批號(hào):378212,純度:99%)等購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó));小鼠抗磷酸化ERK(T204)單克隆抗體(批號(hào):I1009)、兔抗ERK單克隆抗體(批號(hào): I0408)購(gòu)自Santa Cruz(美國(guó));辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(批號(hào):20100112)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DMEM/F12培養(yǎng)液(批號(hào):M76598)和G418 (批號(hào):K27184)購(gòu)自Invitrogen(美國(guó));高靈敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL,批號(hào): S120987)購(gòu)自Millipore(美國(guó));其余所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器 蛋白電泳和轉(zhuǎn)印采用Bio-rad電泳儀(美國(guó)),凝膠成像和分析采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)),蛋白濃度測(cè)定通過(guò)島津UV160-A型紫外分光光度儀(日本)完成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 穩(wěn)定表達(dá)μ阿片受體的CHO細(xì)胞(CHO/μ)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供(2.9 pmol·mg-1膜蛋白)[3],維持于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中,含1×105U·L-1青霉素, 100 mg·L-1鏈霉素和200 mg·L-1的G418,37℃,5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)。細(xì)胞正常傳代培養(yǎng)。

對(duì)于藥物急性刺激,藥物處理前24 h,細(xì)胞以4×105個(gè)種于6孔板,待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合,撤血清過(guò)夜,根據(jù)圖注中描述的方法處理細(xì)胞;對(duì)于慢性給藥,細(xì)胞以密度1×105個(gè)種于6孔板,貼壁后用含藥完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞36 h(期間換含藥培養(yǎng)液1次)。

1.4 免疫印跡 細(xì)胞經(jīng)藥物處理完畢后,立即將6孔板置于冰面,傾倒含藥培養(yǎng)液,4℃磷酸緩沖液(phosphat buffered solution,PBS)洗2次,吸干殘留液體,加入4℃細(xì)胞裂解液60 μL[含三羥甲基氨基甲烷( tris hydroxylmethyl aminomethane,TRIS)50 mmol·L-1,氯化鈉(NaCl)150 mmol·L-1,乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)1 mmol·L-1,依他酸(egtazic acid,EGTA)1 mmol·L-1,1%聚氧乙烯壬基苯醚40[Nonyl phenoxypoly(ethyleneoxy)ethanol-40,NP-40],PMSF1 mmol·L-1;以及蛋白酶抑制劑cocktail和磷酸酶抑制劑(pH=7.4),立即用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下收集入1.5 mL離心管,所有操作在冰上進(jìn)行。冰上繼續(xù)裂解20 min,之后12 000 r·min-1(r=70 mm),4℃,離心20 min,小心吸取上清液,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。

蛋白免疫印跡參照文獻(xiàn)[4]中蛋白免疫印跡法進(jìn)行。取各組樣品蛋白20 μg用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,一抗4℃孵育過(guò)夜。ECL顯影,凝膠成像儀拍照,對(duì)每個(gè)條帶的光密度值進(jìn)行分析。需要再生的膜用適量膜再生液37℃,80 r·min-1,孵育1 h,洗凈膜再生液后,孵育其他一抗。圖1～4中所示印記條帶上方為p44(ERK1),下方為p42(ERK2)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Alpha View軟件中自帶的光密度分析模塊,自動(dòng)扣除背景,獲取光密度值。所有數(shù)據(jù)來(lái)源于3或4次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,ERK的磷酸化水平(pERK1/2)用總ERK量(ERK1/2)均一化,并設(shè)定對(duì)照組為1,其余給藥組表示為對(duì)照組的倍數(shù)。全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析由GraphPad 5.0軟件完成,統(tǒng)計(jì)方法見圖注,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡急性刺激下激活ERK磷酸化的時(shí)效關(guān)系和量效關(guān)系 1 h時(shí)效曲線顯示,與對(duì)照(0 min)相比, 1 μmol·L-1嗎啡處理5 min(q=4.770)和10 min(q= 3.814)時(shí),導(dǎo)致ERK磷酸化水平顯著升高,并在5 min達(dá)峰,約是對(duì)照的2.3倍,隨后逐漸降低,20 min時(shí)接近對(duì)照水平,與對(duì)照比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。嗎啡急性處理5 min的量效關(guān)系結(jié)果顯示,1～10 μmol·L-1嗎啡可以濃度依賴性地引起ERK磷酸化水平升高,與對(duì)照(無(wú)藥物刺激)比較, 0.1 μmol·L-1(q=3.607)、1 μmol·L-1(q=6.885)和10 μmol·L-1(q=9.309)嗎啡均可顯著誘導(dǎo)ERK磷酸化水平升高,誘導(dǎo)程度與嗎啡濃度呈正比(圖2)。為確證ERK磷酸化是由μ阿片受體激動(dòng)所致,使用阿片受體拮抗藥納洛酮(NLX)預(yù)處理細(xì)胞后再用嗎啡刺激,結(jié)果顯示納洛酮預(yù)處理使嗎啡誘導(dǎo)的ERK激活完全消失(q=6.776,圖3),提示ERK磷酸化是由于μ阿片受體激動(dòng)所致。

1 μmol·L-1嗎啡不刺激或刺激細(xì)胞5,10,20,30,60 min,結(jié)束后立即裂解收集,蛋白免疫印跡分析;n=3,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗(yàn),與對(duì)照(0 min)比較,*1P＜0.01圖1 嗎啡誘導(dǎo)ERK磷酸化的時(shí)效曲線Cells were exposed in vehicle or 1 μmol·L-1morphine for 5, 10,20,30,60 min,then lysed and collected for immunoblots.n=3. One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,compared with control(0 min)Fig.1 Time-effect curve of morphine-induced ERK phosphorylation

2.2 慢性嗎啡處理對(duì)ERK磷酸化的影響 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)嗎啡慢性處理來(lái)了解ERK通路做出的反應(yīng),同時(shí)為模仿嗎啡長(zhǎng)期用藥后引起的戒斷反應(yīng),在嗎啡處理36 h后,再用納洛酮催促戒斷。觀察ERK磷酸化的變化模式。因此將細(xì)胞分為對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液處理36 h),嗎啡慢性處理組(嗎啡處理36 h),納洛酮催促5 min組和納洛酮催促10 min組。結(jié)果顯示(圖4),10 μmol·L-1嗎啡慢性處理細(xì)胞36 h后,與對(duì)照組比較,ERK磷酸化水平無(wú)顯著性改變,提示ERK磷酸化對(duì)嗎啡的持續(xù)刺激表現(xiàn)為脫敏。但納洛酮催促后,與對(duì)照組比較,ERK磷酸化水平顯著降低(均P＜0. 01,5 min:q=18.64,10 min:q=20.29),5 min納洛酮催促與10 min納洛酮催促比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同濃度嗎啡刺激細(xì)胞5 min,結(jié)束后立即裂解收集,蛋白免疫印跡分析;n=3,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗(yàn),與對(duì)照組(0 min)比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05圖2 嗎啡誘導(dǎo)ERK磷酸化的量效曲線Cells were stimulated by serial concentration of Morphine for 5 min,then lysed and collected for immunoblots.n=3.One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,*2P＜0.05,compared with the control group(0 min)Fig.2 Dosage-effect curve of morphine-induced ERK phosphorylation

3 討論

ERK通路是一條將胞外信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的重要途徑,該通路通過(guò)三級(jí)蛋白激酶(Raf-MEK-ERK)級(jí)聯(lián)磷酸化而逐次激活,其中ERK包括ERK1和ERK2兩個(gè)亞型,ERK1和ERK2的活化(即磷酸化)是將信號(hào)轉(zhuǎn)移至核的關(guān)鍵[5]。研究發(fā)現(xiàn),阿片受體通路與ERK通路的對(duì)話可能參與到阿片依賴當(dāng)中[6],ERK活性對(duì)于藥物引起的關(guān)聯(lián)性記憶來(lái)說(shuō)是不可或缺的[7]。阿片受體通路與ERK通路之間對(duì)話的機(jī)制尚不清楚,但正是這種對(duì)話機(jī)制的存在,阿片受體既可通過(guò)經(jīng)典的cAMP通路調(diào)節(jié)基因表達(dá);又可通過(guò)ERK通路調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的精細(xì)調(diào)控[1]。利用表達(dá)μ阿片受體的CHO細(xì)胞,研究經(jīng)典藥物嗎啡急慢性刺激下對(duì)ERK活性的影響,以便在體外水平闡述阿片受體在不同激活狀態(tài)下ERK通路的活性變化模式。

Con:對(duì)照溶劑處理細(xì)胞;NLX+morphine:10 μmol·L-1納洛酮預(yù)處理細(xì)胞30 min后,再加1 μmol·L-1morphine處理5 min;morphine:對(duì)照溶劑處理30 min后,再用1 μmol·L-1嗎啡處理5 min。n=4,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗(yàn),與對(duì)照組(Con)比較,*1P＜0.01圖3 納洛酮完全拮抗嗎啡誘導(dǎo)的ERK磷酸化Con:cells were stimulated by vehicle;NLX plus morphine: cells were pretreated by 10 μmol·L-1of Naloxone for 30 min,and then stimulated by 1 μmol·L-1of Morphine for 5 min;Morphine: cells were pretreated by vehicle for 30 min,and then stimulated by 1 μmol·L-1of Morphine for 5 min.n=4,One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,compared with the control group(Con)Fig.3 Antagonism of naloxone on morphine-induced ERK phosphorylation

對(duì)照組(Con)以對(duì)照溶劑慢性處理細(xì)胞36 h,Mor-36 h組, Nlx-5 min組以及Nlx-10 min組以10 μmol·L-1嗎啡處理細(xì)胞36 h,之后催促組(Nlx-5 min,Nlx-10 min)用完全培養(yǎng)液潤(rùn)洗2次,納洛酮5 μmol·L-1處理5或10 min。處理完成后,蛋白免疫印跡分析。n=3,單因素方差分析,Dunnett's post-hoc檢驗(yàn),與con比較,*1P＜0.01圖4 嗎啡慢性處理36 h以及納洛酮催促對(duì)ERK磷酸化的影響Cells were exposed in 10 μmol·L-1morphine(Mor-36 h)or vehicle(Con)for 36 h,and then were washed twice with culture medium,and the withdrawal was preceded by precipitating the cells with 5 μmol·L-1naloxone for 5 min(NLX-5 min)or 10 min (NLX-10 min).n=3,One-way ANOVA was used followed by Dunnett's post-hoc test,*1P＜0.01,compared with control groupFig.4 Effect of chronic morphine treatment for 36 h and naloxone precipitation on ERK phosphorylation

時(shí)效數(shù)據(jù)顯示,1 μmol·L-1嗎啡可以瞬時(shí)刺激細(xì)胞磷酸化ERK水平顯著升高,5 min時(shí)即達(dá)到最大刺激水平,隨后下降,至20 min時(shí)已差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示MOR的激活可以立即通過(guò)ERK通路對(duì)下游靶基因進(jìn)行調(diào)節(jié),但這種調(diào)節(jié)是瞬時(shí)的,ERK的活性很快恢復(fù)到了靜息水平。量效數(shù)據(jù)顯示,在10-9～10-5mol·L-1濃度范圍內(nèi)嗎啡可以劑量依賴性的增強(qiáng)急性ERK磷酸化升高的程度,提示嗎啡給予的劑量與ERK活性正相關(guān)。嗎啡長(zhǎng)時(shí)間的刺激將導(dǎo)致信號(hào)通路的代償性適應(yīng),以cAMP為例,嗎啡急性刺激抑制cAMP合成,但長(zhǎng)時(shí)間的嗎啡刺激將導(dǎo)致AC活性代償性的升高,此時(shí)一旦去除嗎啡并給予阿片受體拮抗藥納洛酮處理,將導(dǎo)致cAMP水平迅速大幅升高,形成所謂的cAMP超射現(xiàn)象[8]。同樣,嗎啡慢性處理下ERK通路一定也存在某種形式的代償性適應(yīng),而且納洛酮催促后可能會(huì)出現(xiàn)某種形式的“戒斷”反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,10 μmol·L-1嗎啡慢性處理細(xì)胞36 h后,ERK的活性水平與對(duì)照比較沒有顯著性變化,提示存在某種機(jī)制使得ERK磷酸化對(duì)嗎啡的刺激脫敏;而用納洛酮催促戒斷后立即觀察可見ERK活性的極其顯著下降,提示這種代償性機(jī)制在沒有了嗎啡的刺激后得到放大,可能因此導(dǎo)致了ERK磷酸化水平的顯著下降。筆者推測(cè),納洛酮催促導(dǎo)致的ERK活性下降或許與cAMP超射有關(guān)。有文獻(xiàn)顯示,PKA可以磷酸化Raf-1 (Raf激酶的一個(gè)重要亞型)的一個(gè)抑制型位點(diǎn)導(dǎo)致Raf-1活性被抑制[9],因此,納洛酮誘導(dǎo)的cAMP水平迅速升高或許引起了PKA活性的快速升高,從而導(dǎo)致Raf-1活性被抑制,繼而導(dǎo)致ERK磷酸化水平下降。但這種代償機(jī)制的設(shè)想還需要進(jìn)一步研究。

[1] BIAN J M,WU N,SU R B,et al.Opioid receptor trafficking and signaling:what happens after opioid receptor activation [J].Cell Mol Neurobiol,2012,32(2):167-184.

[2] ROUX P P,BLENIS J.ERK and p38 MAPK-activated protein kinases:a family of protein kinases with diverse biological functions[J].Microbio Mol Bio Rev,2004,68 (2):320-344.

[3] WU N,SU R B,ZHAO Y,et al.Role of I1-imidazoline receptor on naloxone-induced cAMP overshooting in chronic morphine treated CHO-μ/I1 cells[J].Biochem Pharmcol, 2005,70(7):1079-1087.

[4] LI F,WU N,SU R B,et al.Comparison of agmatine with moxonidine and rilmenidine in morphine dependence in vitro:role of imidazoline I1 receptors[J].Eur J Pharmacol, 2009,612(1-3):1-8.

[5] THOMAS G M,HUGANIR R L.MAPK cascade signalling and synaptic plasticity[J].Nat Rev Neuros,2004,5(3): 173-183.

[6] LIGEZA A,WAWRZCZAK-BARGIEL A,KAMINSKA D,et al.Regulation of ERK1/2 phosphorylation by acute and chronicmorphine-implicationsfortheroleofcAMP-responsive element binding factor(CREB)-dependent and Ets-like protein-1(Elk-1)-dependent transcription;small interfering RNA-based strategy[J].FEBS J,2008,275 (15):3836-3849.

[7] GIRAULT J A,VALJENT E,CAHOCHE J,et al.ERK2:a logical and gate critical for drug-induced plasticity[J].Curr Opin Pharmacol,2007,7(1):77-85.

[8] SHY M,CHAKRABARTI S,GINTZLER A R.Plasticity of adenylyl cyclase-related signaling sequelae after long-term morphine treatment[J].Mol Pharmacol,2008,73(3):868-879.

[9] DHILLON A S,VON KRIEGSHEIM A,GRINDLAY J,et al. Phosphatase and feedback regulation of Raf-1 signaling[J]. Cell Cycle,2007,6(1):1-7.

DOI 10.3870/yydb.2014.11.012

Effects of Morphine on μ Opioid Receptor-mediated ERK Phosphorylation

BIAN Jia-ming,ZHANG Mei
(Department of Pharmacology,Military General Hospital of Beijing PLA,Beijing 100700,China)

ObjectiveTo study the phosphorylation mode of extracellular regulated kinase(ERK)induced by acute and chronic morphine treatment on Chinese hamster ovary(CHO)cells expressed with μ opioid receptors.MethodsThe time course of ERK phosphorylation 1 h and 36 h after morphine exposure as well as naloxone-precipitated withdrawal was detected by immunobloting.ResultsA transient enhancement of ERK phosphorylation was induced by 1 μmol·L-1morphine with the peak effect at 5 min(P＜0.01),and the effect was dose-dependent.No difference in ERK phosphorylation was found after 36h of treatment with 10 μmol·L-1morphine compared with the control.However,5 or 10 min-naloxone precipitation induced remarkable decrease in ERK phosphorylation compared with the control(P＜0.01).ConclusionDifferent changes of ERK phosphorylation were found under acute and chronic morphine treatment and naloxone precipitation,indicating a compensation of ERK related pathway induced by μ opioid receptors.

Morphine;μ opioid receptor;Ovary cells;ERK;Phosphorylation

R971;R965

A

1004-0781(2014)11-1446-04

2013-11-15

2013-12-05

邊佳明(1976-),男,內(nèi)蒙古集寧人,主管藥師,博士,研究方向:分子藥理學(xué)、遺傳藥理學(xué)。電話:010-66721898,E-mail:bianbenjamin@163.com。