武艷,楊嵐,張羽飛,袁曉環(huán),初彥輝
(1.牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心,牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院眼科,牡丹江 157011)
bFGF對成纖維細胞增殖和膠原及纖維連接蛋白的影響*
武艷1,楊嵐2,張羽飛1,袁曉環(huán)1,初彥輝1
(1.牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心,牡丹江 157011;2.牡丹江醫(yī)學院紅旗醫(yī)院眼科,牡丹江 157011)
目的 探討堿性成纖維細胞因子(bFGF)調(diào)節(jié)皮膚創(chuàng)傷修復的作用機制。方法采用組織塊貼壁法培養(yǎng)來源于正常皮膚和增生性瘢痕的成纖維細胞(FB),加入含有不同濃度bFGF(0,0.1,1,10,100,1 000 ng·mL-1)的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h,采用細胞計數(shù)法和錐蟲藍染色檢測各組FB增殖和凋亡,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)分別檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白濃度及基因表達情況。結(jié)果bFGF促進FB增殖,當濃度過高時則抑制FB增殖,促進其凋亡,并且增生性瘢痕FB增殖較來源于正常皮膚的FB緩慢;bFGF明顯抑制增生性瘢痕FBⅠ型膠原產(chǎn)生,對來源于正常皮膚FB無影響;bFGF上調(diào)來源于正常皮膚FB的纖維連接蛋白基因表達,對增生性瘢痕FB中的表達無影響;bFGF對兩種來源的FBⅢ型膠原的分泌和表達均無顯著作用。結(jié)論bFGF對來源正常皮膚和增生性瘢痕的FB具有不同的影響和作用機制,可能對創(chuàng)傷修復早期和瘢痕形成過程發(fā)揮作用。
堿性成纖維細胞因子;成纖維細胞;增生性瘢痕;創(chuàng)傷修復
創(chuàng)傷修復是多種細胞因子、成纖維細胞(fibroblast,FB)及細胞外基質(zhì)相互作用的復雜的動態(tài)過程。其中FB在創(chuàng)傷修復中通過分泌膠原和纖維連接蛋白形成臨時支架而發(fā)揮重要作用[1]。而來源于單核巨噬細胞或淋巴細胞等的生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、堿性成纖維細胞因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等能夠吸引不用類型的細胞移動到創(chuàng)傷部位從而促進創(chuàng)傷修復[2]。已有研究證實bFGF對FB和內(nèi)皮細胞具有趨化作用[3]。另外,也有研究證實bFGF可有效調(diào)節(jié)肉芽組織形成和膠原合成,從而促進無瘢痕修復[4],但其減少增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)、促進創(chuàng)傷修復的作用機制仍不清楚。Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白是創(chuàng)傷修復中形成臨時性支架的結(jié)構(gòu)分子,筆者在本研究中擬采用不同濃度bFGF作用于來源于人正常皮膚和HS的FB,檢測3種蛋白的表達,旨在探討bFGF抑制瘢痕形成的作用機制。
1.1 主要試劑與儀器 達爾伯克伊格爾改良培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM,批號: 1036941)、青霉素和鏈霉素混合液(批號:1078516)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,批號:1036489)、胰蛋白酶(批號:1081134)均購自美國Gibco公司;錐蟲藍(批號:0905291321)購自中國碧云天生物技術(shù)研究所;Trizol (批號:1173364)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:998897)購自美國Invitrogen公司;Ⅰ型膠原(批號:E0040)、Ⅲ型膠原(批號:201210)和纖維連接蛋白(批號:201206)、酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于上海博谷生物科技有限公司;二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司;倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司(型號:IX70-142);聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀購自德國Eppendorf公司(型號:5331)。
1.2 FB的培養(yǎng) 皮膚瘢痕組織取自6例(男、女各3例,年齡18~53歲)同期住院患者手術(shù)切除的創(chuàng)傷愈合成熟期的HS組織(以往沒有接受過任何治療),經(jīng)病理組織學檢查確診。正常組織取自同期住院的非皮膚病經(jīng)外科手術(shù)的患者皮膚。取材均得到患者知情同意,并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。將收集的皮膚組織切去表皮,并將標本切成約1 mm3小塊,置于培養(yǎng)皿,待組織貼壁后,加入10%胎牛血清、含100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素的DMEM,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換液,之后每2~3 d更換培養(yǎng)液1次。顯微鏡下觀察,待細胞基本爬滿瓶底后,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1∶3比例傳代培養(yǎng)。實驗所用細胞為3~5代,細胞融合達70%~80%后,加入含有不同濃度的bFGF(0,0.1,1,10,100, 1 000 ng·mL-1)無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h。
1.3 FB增殖和凋亡的檢測 加入含不同濃度bFGF的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h,胰酶消化,收集細胞。錐蟲藍染色,細胞計數(shù)器計數(shù)。重復3次。
1.4 ELISA檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白濃度 皮膚FB條件培養(yǎng)液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的濃度采用ELISA檢測,按照說明書檢測方法操作,用酶標儀檢測,波長450 nm。
1.5 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的表達 加入含有不同濃度bFGF的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h,進行RNA提取、cDNA轉(zhuǎn)錄及PCR檢測。RT-PCR的引物序列如下:Ⅰ型膠原:正義,5′-CAT GCC GTG ACT TGA GAC TCA-3′,反義,5′-AGG CGC ATG AAG GCA AGT T-3′;Ⅲ型膠原:正義,5′-CGA GCT TCC CAG AAC ATC ACA-3′,反義, 5′-TTC GTG CAA CCA TCC TCC A-3′;纖維連接蛋白:正義,5′-TTC CTT GCT GGT ATC ATG GCA-3′,反義, 5′-TAT TCG GTT CCC GGT TCC A-3′;β-actin:正義,5′-GCC CTG AGG CAC TCT TCC A-3′,反義,5′-GCG GAT GTC CAC GTC ACA-3′。PCR反應條件:95℃預變性5 min,94℃50 s、57℃50 s、72℃60 s,共30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳,80 V電泳25 min,凝膠成像儀照相存盤。
2.1 bFGF對FB增殖和凋亡的影響 將來源于正常皮膚和HS的FB置于無bFGF和bFGF中培養(yǎng),隨著bFGF濃度的增加,FB增殖數(shù)量變化很大。當bFGF濃度為100 ng·mL-1時,來源于正常皮膚FB的增殖細胞數(shù)達到最高值,而來源于HS的FB在bFGF濃度為10 ng·mL-1時增殖達最高值。當bFGF濃度繼續(xù)增加達到1 000 ng·mL-1時,兩組FB細胞數(shù)都有所下降, bFGF對來源于HS的FB效果更明顯,下降約68%,見表1。bFGF的濃度為1 000 ng·mL-1時,來源于HS的FB染色陽性的細胞數(shù)增加明顯,而各種濃度的bFGF對來源于正常皮膚FB凋亡沒有顯著影響,見表2。
表1 不同濃度bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB增殖的影響Tab.1 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast proliferation of normal skin and hypertrophic scar 個,±s,n=10
表1 不同濃度bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB增殖的影響Tab.1 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast proliferation of normal skin and hypertrophic scar 個,±s,n=10
與未加入bFGF組比較,*1P<0.05,*2P<0.01Compared with fibroblasts not treated by bFGF,*1P<0.05,*2P<0.01
bFGF濃度/ (ng·mL-1)正常皮膚FB增殖/×105HS的FB增殖/×1050 8.25±0.8917.89±1.49 0.19.59±1.1220.46±1.56 1 16.72±1.89*129.18±2.46*11041.50±3.89*242.58±3.82*210055.14±4.12*229.80±2.01*11 00034.98±2.56*213.89±1.28
2.2 bFGF對FB分泌Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白影響 無bFGF培養(yǎng)條件下,來源于HSFB分泌的Ⅰ型膠原比來源于正常皮膚FB高。而bFGF濃度越高,越會抑制HS的FB分泌Ⅰ型膠原;bFGF的濃度對來源于正常皮膚FB分泌Ⅰ型膠原無顯著影響,見表3。bFGF對于這兩種來源的FB影響來說,其Ⅲ型膠原無明顯變化,見表4。在bFGF的影響下,來源于正常皮膚FB的纖維連接蛋白分泌增加,而HS的FB分泌無明顯變化,見表5。
表2 不同濃度bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB凋亡的影響Tab.2 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast apoptosis of normal skin and hypertrophic scar 個,±s,n=10
表2 不同濃度bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB凋亡的影響Tab.2 Effect of different concentration of bFGF on fibroblast apoptosis of normal skin and hypertrophic scar 個,±s,n=10
與未加入bFGF組比較,*1P<0.01Compared with fibroblasts not reated by bFGF,*1P<0.01
bFGF濃度/ (ng·mL-1)正常皮膚FB凋亡/×105HS的FB凋亡/×1050 3.10±0.213.15±0.02 0.13.20±0.253.16±0.26 1 3.19±0.293.21±0.27 103.21±0.313.19±0.31 1003.24±0.273.64±0.32 1 0003.18±0.265.79±0.48*1
表3 bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB分泌的影響Tab.3 Effect of bFGF on fibroblasts secretion of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s
表3 bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB分泌的影響Tab.3 Effect of bFGF on fibroblasts secretion of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s
與同組無bFGF培養(yǎng)的成纖維細胞比較,*1P<0.01;與來源正常皮膚的FB比較,*2P<0.01Compared with fibroblasts not treated by bFGF,*1P<0.01; Compared with fibroblasts from normal skin,*2P<0.01
bFGF濃度/ (ng·mL-1)正常皮膚FB (Ⅰ型膠原) HS的FB (Ⅰ型膠原) 0 0.019±0.0050.028±0.006*10.10.018±0.0030.018±0.004*11 0.016±0.0020.015±0.005*2100.017±0.0030.017±0.004*21000.018±0.0030.016±0.004*21 0000.016±0.0040.015±0.003*2
2.3 bFGF對FB的Ⅰ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白基因表達的影響 無bFGF培養(yǎng)條件下,來源于HS的FBⅠ型膠原的表達明顯高于來源于正常皮膚的FB。HS的FB在bFGF濃度分別為1,10,100,1 000 ng·mL-1時,其Ⅰ型膠原的表達分別下降了52%,55%,61%,63%,而bFGF濃度對來源于正常皮膚FBⅠ型膠原的表達無影響。從圖1中可以看到,bFGF對來源于HS的FB和來源于正常皮膚的FBⅢ型膠原的基因表達都沒有顯著影響。而纖維連接蛋白在HS的FB中表達無變化,在來源于正常皮膚的FB中表達增加。
表4 bFGF對來源于正常皮膚和增生性瘢痕的FBⅢ型膠原分泌的影響Tab.4 Effect of bFGF on type III collagen secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s
表4 bFGF對來源于正常皮膚和增生性瘢痕的FBⅢ型膠原分泌的影響Tab.4 Effect of bFGF on type III collagen secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s
bFGF濃度/ (ng·mL-1)正常皮膚FB (Ⅲ型膠原) HS的FB (Ⅲ型膠原) 0 0.190±0.0290.310±0.031 0.10.168±0.0270.297±0.029 1 0.172±0.0310.269±0.025 100.165±0.0290.275±0.021 1000.161±0.0260.246±0.028 1 0000.153±0.0190.210±0.022
表5 bFGF對來源于正常皮膚和增生性瘢痕的FB纖維連接蛋白分泌的影響Tab.5 Effect of bFGF on fibronectin secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s
表5 bFGF對來源于正常皮膚和增生性瘢痕的FB纖維連接蛋白分泌的影響Tab.5 Effect of bFGF on fibronectin secretion by fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar μg·mL-1·mg-1,±s
與未加入bFGF組比較,*1P<0.01Compared with fibroblasts untreated by bFGF,*1P<0.01
bFGF濃度/ (ng·mL-1)正常皮膚FB (纖維連接蛋白) HS的FB (纖維連接蛋白) 0 0.120±0.0180.190±0.020 0.10.140±0.0190.170±0.018 1 0.180±0.0180.160±0.016 100.230±0.0200.190±0.018 1000.340±0.031*10.185±0.019 1 0000.310±0.025*10.178±0.015
皮膚損傷修復與成纖維細胞增殖以及膠原形成密切相關(guān),而過多的成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)形成則會形成瘢痕[5]。在此過程中,許多細胞因子參與其中,已有研究證明bFGF對于創(chuàng)傷修復以及瘢痕形成具有積極的作用[6],但其具體分子機制還不清楚。在本研究中,筆者確定bFGF對來源于正常皮膚和HS的FB增殖、膠原和纖維連接蛋白表達合成的影響作用。
在體內(nèi)實驗中,給予bFGF治療能夠明顯抑制FB分化以及成纖維細胞的過多形成[4];ONO等[7]則發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)傷修復早期(4~7 d)因細胞增殖超過了細胞凋亡數(shù)量,故而bFGF可誘導肉芽組織形成,創(chuàng)傷修復后期(14 d)由于細胞凋亡增加而使肉芽組織生長被抑制。本實驗中,將來源于正常皮膚和HS的FB置于含有不用濃度bFGF的培養(yǎng)液中培養(yǎng),通過檢測這兩種細胞的增殖和凋亡發(fā)現(xiàn),bFGF在一定濃度時促進FB增殖,達到一定程度時抑制FB增殖,促進其凋亡,且HS FB的增殖比來源于正常皮膚的FB更緩慢。
圖1 bFGF對來源于正常皮膚和HS的FBⅠ型、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白基因表達的影響Fig.1 Effect of bFGF on gene expression of typeⅠ/Ⅲcollagen and fibronectin in fibroblasts of normal skin and hypertrophic scar
本研究發(fā)現(xiàn),HS FB比正常皮膚來源的FB產(chǎn)生Ⅰ型膠原多[8],而Ⅰ型膠原可以被大劑量bFGF明顯抑制。此研究結(jié)果與CHOI等[9]的研究一致,bFGF的抑制作用與其下調(diào)Ⅰ型膠原的表達關(guān)系密切。另外,既往研究發(fā)現(xiàn),在創(chuàng)傷修復早期,Ⅲ型膠原比例上升,本實驗發(fā)現(xiàn)bFGF對兩種來源的FBⅢ型膠原的合成都沒有影響[10]。已有學者研究證實,在創(chuàng)傷修復的早期,纖維連接蛋白的表達被上調(diào),是組成臨時支架的一部分,也會促進FB遷移,而過多的纖維連接蛋白沉積可能促進HS的形成[11]。本實驗結(jié)果顯示,bFGF上調(diào)了來源于正常皮膚FB的纖維連接蛋白基因的表達,促進了其蛋白的產(chǎn)生,而對在HF FB中表達無影響。
本研究結(jié)果表明,bFGF既可以抑制來源于HS FB的Ⅰ型膠原的表達合成,也可以促進來源于正常皮膚FB的纖維連接蛋白的表達,這說明bFGF在早期創(chuàng)傷修復以及瘢痕形成過程的作用機制。本研究為bFGF在臨床上治療及預防增生性瘢痕提供了實驗基礎(chǔ)。
[1] WERNER S,GROSE R.Regulation of wound healing by growth factors and cytokines[J].Physiol Rev,2003,83 (3):835-870.
[2] SHAW T J,MARTIN P.Wound repair at a glance[J].J Cell Sci,2009,122(Pt 18):3209-3213.
[3] ORTEGA S,ITTMANN M,TSANG S H,et al.Neuronal defects anddelayedwoundhealinginmicelacking fibroblast growth factor 2[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(10):5672-5677.
[4] AKASAKA Y,ONO I,YAMASHITA T,et al.Basic fibroblast growth factor promotes apoptosis and suppresses granulation tissue formation in acute incisional wounds[J].J Pathol, 2004,203(2):710-720.
[5] 馮幼平.粉防己堿對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響[J].醫(yī)藥導報,2008,27(12):1455-1457.
[6] 林麗,林紹強,王曉玉,等.bFGF對人臍帶間充質(zhì)干細胞增殖及膠原產(chǎn)生的影響[J].中國病理生理雜志,2013, 29(3):509-514.
[7] ONO I,AKASAKA Y,KIKUCHI R,et al.Basic fibroblast growth factor reduces scar formation in acute incisional wounds[J].Wound Repair Regen,2007,15(5):617-623.
[8] WIDGEROW-MBBCH A D,MMED F.Cellular/extracellular matrix cross-talk in scar evolution and control[J].Wound Repair Regen,2011,19(2):117-133.
[9] CHOI W,KAWANABE H,SAWA Y,et al.Effects of bFGF on suppression of collagen type I accumulation and scar tissue formation during wound healing after mucoperiosteal denudation of rat palate[J].Acta Odontol Scand,2008,66 (1):31-37.
[10] BOUDKO S P,ENGEL J,OKUYAMA K,et al.Crystal structure of human typeⅢcollagen ly991-Gly1032 cystine knot-containing peptide shows oth 7/2 and 10/3 triple helical symmetries[J].J Biol Chem,2008,283(47): 32580-32589.
[11] KWON A H,QIU Z,HIRAO Y.Topical application of plasma ibronectin in full-thickness skin wound healing in rats[J].Exp Biol Med,2007,232(7):935-941.
DOI 10.3870/yydb.2014.11.004
Effects of Basic Fibroblast Growth Factor on Proliferation as well as Collagen and Fibronectin Expression on Fibroblasts
WU Yan1,YANG Lan2,ZHANG Yu-fei1,YUAN Xiao-huan1,CHU Yan-hui1
(1.Medical Research Center, Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,China;2.Department of Ophtalmology,Hongqi Hospital, Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157011,China)
ObjectiveTo explore the mechanism and effects of basic fibroblast growth factor(bFGF)on skin wound healing.MethodsFibroblasts(FB)were isolated from normal skin and hypertrophic scar and cultivated by direct adherence method.FB were then treated with different concentrations of bFGF(0,0.1,1,10,100,1 000 ng·mL-1)and cultivated with serum-free medium for 72 hours.The proliferation and apoptosis of FB in each group were detected by cell counting and trypan blue staining.Content and gene expression of typeⅠand typeⅢcollagen and fibronectin were determined by ELISA and RTPCR,respectively.ResultsbFGF promoted the proliferation of FB at low concentrations promoted apoptosis of FB at higher concentrations.The proliferation of FB from hypertrophic scar was slower than that from the normal skin.bFGF significantly inhibited typeⅠcollagen production from hypertrophic scar FB but not from the normal skin.Moreover,bFGF up-regulated fibronectin expression in the normal fibroblasts,but not in the hypertrophic scar.No change in typeⅢcollagen expression and production was observed in FB from either source.ConclusionbFGF has differential effects and mechanisms on FB of the normal skin and hypertrophic scar,suggesting that bFGF may play a role in early phase of skin wound healing and scar formation.
Basic fibroblast growth factor;Fibroblast;Hypertrophic scar;Wound healing
R982;R965
A
1004-0781(2014)11-1416-04
2013-11-05
2013-12-10
*2014年黑龍江省教育廳青年學術(shù)骨干支持計劃項目(1254G064)
武艷(1982-),女,黑龍江牡丹江人,講師,博士,研究方向:組織損傷與修復。電話:0453-6984647,E-mail:wuyannini@126.com。
初彥輝(1964-),男,黑龍江牡丹江人,教授,博士,研究方向:組織工程。電話:0453-6984623,E-mail:yanhui_ chu@sina.com。