潘曉麗,熊永愛(ài),譚玉柱,向暉

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137)

馬齒莧總黃酮對(duì)肝纖維化大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1信號(hào)因子表達(dá)的影響

潘曉麗,熊永愛(ài),譚玉柱,向暉

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,成都 611137)

目的 觀察馬齒莧總黃酮對(duì)肝纖維化大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1基因及其蛋白表達(dá)的影響,探討馬齒莧總黃酮對(duì)肝纖維化的治療作用機(jī)制。方法SD大鼠48只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方甘草酸苷組、馬齒莧總黃酮組,各12只。除正常對(duì)照組外,其余各組大鼠腹腔注射四氯化碳(CCl4)溶液2 mL·kg-1·d-1復(fù)制肝纖維化模型。復(fù)方甘草酸苷組灌胃復(fù)方甘草酸苷溶液15.75 mg·kg-1,馬齒莧總黃酮組灌胃馬齒莧總黃酮溶液35.6 mg·kg-1,正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等體積純凈水。30 d后麻醉處死動(dòng)物剖取肝臟,實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western-Blot法檢測(cè)肝臟細(xì)胞TGF-β1基因及蛋白表達(dá)。結(jié)果正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方甘草酸苷組、馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟細(xì)胞中TGF-β1基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.725±0.130,7.493±1.410,3.016±1.240,2.668±1.150。馬齒莧總黃酮可顯著下調(diào)TGF-β1基因(P＜0.01)及TGF-β1蛋白(P＜0.01)的表達(dá)。結(jié)論馬齒莧總黃酮可通過(guò)下調(diào)大鼠肝纖維化細(xì)胞TGF-β1基因及蛋白表達(dá)有效治療肝細(xì)胞纖維化病變。

馬齒莧總黃酮;肝硬化;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

肝纖維化是指由多種慢性疾病引起的肝臟持續(xù)的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)而導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉積和肝臟功能的受損[1]。研究表明,多種細(xì)胞參與了肝纖維化的形成,其中激活的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是促進(jìn)ECM過(guò)度沉積的主要細(xì)胞[2],而多種細(xì)胞因子參與了HSC的激活,其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)被認(rèn)為是最關(guān)鍵的因素[3]。其可激活HSC和調(diào)節(jié)ECM的合成和降解平衡。以干擾TGF-β1及其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的抗肝纖維化治療已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

馬齒莧(Portulaca oleraceaL.)又名瓜子菜,為馬齒莧科馬齒莧屬植物,具有解毒、抗炎、利尿、鎮(zhèn)痛功效。馬齒莧富含黃酮、皂苷、生物堿等天然活性成分,具有多種藥理作用,如抗菌、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗心血管疾病、增強(qiáng)免疫力等[4]。馬齒莧黃酮是馬齒莧中主要活性成分之一,具有降脂、抗血栓、抗氧化等藥理活性,主要有槲皮素、山奈素、楊梅素、芹菜素、木犀草素等[5]。筆者尚未見(jiàn)關(guān)于馬齒莧黃酮對(duì)肝纖維化病變的治療或保護(hù)作用的報(bào)道,筆者在本實(shí)驗(yàn)中擬以馬齒莧總黃酮為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)肝纖維化病變過(guò)程中肝細(xì)胞TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵成員TGF-β1的干預(yù),初步研究馬齒莧黃酮預(yù)防肝纖維化病變的作用機(jī)制,為研究肝纖維化病變細(xì)胞TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中其他成員奠定基礎(chǔ),也為開(kāi)發(fā)馬齒莧肝靶向制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 斯波雷格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠48只,SPF級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量180～220 g。由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK (川)2008-24。使用許可證號(hào):SCXK(川)2009-124。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(22±3)℃,濕度(55±5)%。

1.2 藥物與試劑 馬齒莧總黃酮(自制)。陽(yáng)性藥:復(fù)方甘草酸苷,日本米諾發(fā)源制藥株式會(huì)社秋山片劑株式會(huì)社生產(chǎn),批號(hào):20121014。RNAiso Plus Kit,批號(hào):BK3303；PrimeScript RT reagent Kit,批號(hào):BK501；SYBR Premix Ex Taq II Kit,批號(hào):BK402,均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)；蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)研究所,批號(hào):P0015)；聚丙烯酰胺凝膠電泳預(yù)染蛋白MAKER(美國(guó)FERMENTAS公司,批號(hào):SM0441)；TGF-β1兔抗鼠一抗(Cellsignalling公司,批號(hào):9103)。四氯化碳溶液(Sigma公司,純度＞99.9%,批號(hào):S1272-03-9)。

1.3 儀器 電子天平(BS-600L,上海友聲衡器有限公司)；實(shí)時(shí)-聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)擴(kuò)增儀(PIKORed96,美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)；勻漿機(jī)(DY89-I,寧波新芝生物科技股份有限公司)；垂直電泳槽(UK-33,美國(guó)Bio-RAD公司)；電泳儀(DYY-6C,北京六一儀器廠)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)Bio-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 SD大鼠48只,隨機(jī)分為4組,每組12只,分別為:①模型對(duì)照組:給予等體積純凈水；②復(fù)方甘草酸苷組:給予復(fù)方甘草酸苷溶液15.75 mg·kg-1；③馬齒莧總黃酮組:給予馬齒莧總黃酮溶液35.6 g·kg-1；④正常對(duì)照組:給予等體積純凈水。于實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始灌胃給予藥物或純凈水,連續(xù)30 d。

1.4.2 大鼠肝纖維化模型的建立 實(shí)驗(yàn)第1天開(kāi)始,除正常對(duì)照組外,其余各組大鼠按2 mL·kg-1·d-1劑量腹腔注射四氯化碳溶液,正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)第31天,用20%水合氯醛溶液麻醉處死動(dòng)物,使用大號(hào)鈍剪刀迅速剖取大鼠肝臟,將其置于冰盤上,于冰冷0.9%氯化鈉溶液中洗凈血跡后,裝于焦碳酸二乙酯溶液處理過(guò)的EP管中,放置液氮中快速冷凍,然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱凍存,待做RT-PCR；取另部分肝臟放入高壓滅菌的空白EP管內(nèi),置-80℃冰箱凍存,待做Western-Blot。

1.4.3 肝臟組織TGF-β1基因表達(dá)檢測(cè) Trizol法提取大鼠肝臟總RNA,分光光度法測(cè)定其在波長(zhǎng)為260與280 nm處的吸光度(A值),用A260/A280估計(jì)RNA純度,約2.0,提示為RNA純品。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR數(shù)據(jù)收集由7000 System SDS Software軟件完成,通過(guò)軟件計(jì)算所有樣品的Ct值,以β-actin作為內(nèi)參照基因進(jìn)行校準(zhǔn),采用2-△△Ct方法對(duì)TGF-β1基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量:△Ct=Ct (target)-Ct(ref)；Avg.△Ct(calibrator)=Avg.Ct (target,calibrator)-Avg.Ct(ref,calibrator)；△△Ct=△Ct-Avg.△Ct(calibrator)；2-△△Ct表示通過(guò)參照基因校準(zhǔn)的TGF-β1基因的相對(duì)表達(dá)水平。TGF-β1和βactin引物信息見(jiàn)表1。

表1 TGF-β1和β-action引物Tab.1 Primer of TGF-β1and β-action

1.4.4 肝臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)檢測(cè) 細(xì)胞裂解法提取大鼠肝臟總蛋白,Lowry法蛋白定量,聚丙烯酰胺凝膠電泳,Western-Blot蛋白質(zhì)印跡。應(yīng)用Tanon-2500R型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)成像,使用ScionImage軟件對(duì)蛋白電泳帶進(jìn)行灰度值分析,以βactin作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn),采用TGF-β1蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來(lái)表示TGF-β1的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間采用單因素方差分析,方差齊者組間進(jìn)行LSD檢驗(yàn),方差不齊者進(jìn)行Tamhane’s T2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 RT-PCR熔解曲線分析 各組大鼠TGF-β1和β-actin熔解曲線中均有單一的主峰,TGF-β1的熔解溫度(Tm值)均為86.12℃,β-actin的Tm值均為85.24℃,相同擴(kuò)增條件下重復(fù)多次,得到的TGF-β1和β-actin熔解溫度上下浮動(dòng)不超過(guò)1℃,熔解曲線單一峰無(wú)非特異性熒光,說(shuō)明產(chǎn)物特異性強(qiáng),無(wú)引物二聚體,定量準(zhǔn)確,見(jiàn)圖1,2。

圖1 TGF-β1熒光定量PCR熔解曲線Fig.1 RT-PCR melt curve of TGF-β1

圖2 β-action熒光定量PCR熔解曲線Fig.2 RT-PCR melt curve of β-action

2.1.2 TGF-β1基因的2-△△CT值 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方甘草酸苷組、馬齒莧總黃酮組大鼠肝細(xì)胞中TGF-β1基因的2-△△CT值分別為0.725±0.130,7.493± 1.410,3.016±1.240,2.668±1.150。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞中TGF-β1基因的2-△△CT值顯著增大(P＜0.01),提示TGF-β1基因在纖維化肝細(xì)胞中呈過(guò)表達(dá)；與模型對(duì)照組比較,馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟細(xì)胞中TGF-β1基因的2-△△CT值顯著減小(P＜0.01),提示馬齒莧總黃酮可顯著抑制大鼠纖維化肝細(xì)胞異常表達(dá)TGF-β1基因。TGF-β1基因和β-actin擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖3,4。

2.2 大鼠肝臟細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖5。與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)顯著增大(P＜0.01),與RT-PCR結(jié)果一致；與模型對(duì)照組比較,馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)顯著減小(P＜0.01)。各組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot見(jiàn)圖6～9。

圖3 TGF-β1熒光定量擴(kuò)增曲線Fig.3 Fluorescence quantitative expansion curve of TGF-β1

圖4 β-actin熒光定量擴(kuò)增曲線Fig.4 Fluorescence quantitative expansion curve of βactin

3 討論

肝纖維化常見(jiàn)的原因是由于乙醇、缺血、寄生蟲(chóng)、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、自體免疫攻擊、非酒精性脂肪肝疾病、藥物治療,以及肝毒素等因素誘發(fā)肝細(xì)胞損傷,導(dǎo)致肝Kupffer細(xì)胞、肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、肝成纖維細(xì)胞等其他類型肝細(xì)胞以及遷移的炎性細(xì)胞活化并釋放大量的細(xì)胞因子和可溶因子,與此同時(shí)這些因子導(dǎo)致HSC或肝MFB細(xì)胞活化、分化與增殖,合成大量ECM,并逐漸沉積從而引起肝纖維化[6-7]。肝細(xì)胞、炎性細(xì)胞以及細(xì)胞因子之間相互影響并且形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著肝細(xì)胞的慢性損傷和纖維化,肝臟的結(jié)構(gòu)和新陳代謝受到嚴(yán)重破壞,最終會(huì)導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌,對(duì)人類的健康和生命具有極大的威脅。因此,對(duì)肝纖維化疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的最重要的細(xì)胞因子TGF-β1的動(dòng)態(tài)變化及作用進(jìn)行追蹤,對(duì)于研究肝纖維化疾病的發(fā)生機(jī)制及治療具有重要意義。

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.01,*2P＜0.05圖5 4組大鼠肝臟TGF-β1蛋白相對(duì)表達(dá)量Compared with model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05Fig.5 Relative expression of TGF-β1protein of livers in four groups of rats

圖6 正常對(duì)照組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.6 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from normal control group

圖7 模型對(duì)照組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.7 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from model control group

本研究顯示,馬齒莧總黃酮可顯著下調(diào)大鼠肝細(xì)胞中TGF-β1基因及其蛋白表達(dá),提示馬齒莧總黃酮可能通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠肝組織中TGF-β1蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)通路,避免其過(guò)度激活,進(jìn)而抑制了TGF-β1/Smad7信號(hào)通路其他關(guān)鍵成員的活化,最終減少了炎性因子的釋放,減輕了肝細(xì)胞炎癥,起到一定的抗肝纖維化作用。

圖8 復(fù)方甘草酸苷組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.8 Western-Blot analysis on TGF-β1protein of livers in rats from glycyrrhizin aqueous group

圖9 馬齒莧總黃酮組大鼠肝臟TGF-β1蛋白Western-Blot圖Fig.9 Western-Blot analyisis on TGF-β1protein of livers in rats from total flavonoids group

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.006

Effects of Total Flavonoids from Portulaca on Transforming Growth Factor β1in Rats with Hepatic Fibrosis

PAN Xiao-li,XIONG Yong-ai,TAN Yu-zhu,XIANG Hui
(School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective To explore the effects of total flavonoids from portulaca against liver fibrosis in rats by detecting TGF-β1gene and protein expressions.MethodsA total of 48 SD rats were randomly divided into normal control,model control,glucyrrhizin aqueous,and total flavonoids groups,with 12 rats in each group.Except those in the normal control group, rats in other groups were intraperitoneally injected with 2 mL·kg-1·d-1carbon tetrachloride to induce liver fibrosis.Rats in glucyrrhizin aqueous group and total flavonoids ones were intragastrically administered with 15.75 mg·kg-1of glucyrrhizin aqueous solution or 35.6 mg·kg-1of total flavonoids aqueous solution,respectively.The normal and model control groups were administered with equal volume of aqueous solution.Thirty days later,rats were sacrificed by anesthesia.Livers were obtained to detect TGF-β1gene and protein expressions by RT-PCR and Western-Blot.ResultsRelative gene expression of TGF-β1in the normal control,model control,glucyrrhizin aqueous and flavonoids groups was 0.725±0.130,7.493±1.410,3.016±1.240,and 2.668±1.150,respectively.Total flavonoids from portulaca significantly reduced the gene(P＜0.01)and protein(P＜0.01) expressions of TGF-β1.ConclusionEfficacy of total flavonoids from portulaca in treating hepatic fibrosis may be related to decreased TGF-β1expression in rats.

Total flavonoids from portulaca;Liver cirrhosis;Transforming growth factors

R285.5；R575.2

A

1004-0781(2014)09-1140-04

2013-04-24

2013-09-16

潘曉麗(1980-),女,重慶人,講師,碩士,主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究。電話:(0) 13880768673,E-mail:panpan_1388@sohu.com。