潘強,楊學軍,高松,紀延偉,張文高

(1.山東省萊蕪市人民醫(yī)院、泰山醫(yī)學院附屬萊蕪醫(yī)院神經(jīng)外科,萊蕪 271100；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)外科,天津 300052；3.天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胰腺腫瘤科,天津 300060；4.山東省交通醫(yī)院神經(jīng)外科,濟南 250031；5.河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,滄州 061001)

·藥物研究·

替莫唑胺耐藥人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251/TR建立及耐藥機制*

潘強1,楊學軍2,高松3,紀延偉4,張文高5

(1.山東省萊蕪市人民醫(yī)院、泰山醫(yī)學院附屬萊蕪醫(yī)院神經(jīng)外科,萊蕪 271100；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)外科,天津 300052；3.天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胰腺腫瘤科,天津 300060；4.山東省交通醫(yī)院神經(jīng)外科,濟南 250031；5.河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,滄州 061001)

目的 建立替莫唑胺耐藥人腦膠質(zhì)瘤細胞系,探討其耐藥機制,以期為臨床優(yōu)化藥物化療方案提供參考。方法通過體外分步誘導(dǎo)方法使人U251膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺產(chǎn)生耐藥,噻唑藍比色法檢測耐藥指數(shù)及細胞存活率;采用Western-Blot、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈免疫(RT-PCR)、免疫熒光、免疫組化法檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)表達變化,分析細胞耐藥機制。結(jié)果歷經(jīng)8個月成功建立了對替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)瘤細胞U251/TR,在替莫唑胺初始濃度為0.25 μg·mL-1,終濃度為16.00 μg·mL-1培養(yǎng)液中,U251/TR細胞半數(shù)抑制濃度(IC50)為未經(jīng)誘導(dǎo)的U251膠質(zhì)瘤細胞的7倍(P=0.00),其耐藥指數(shù)約為7.00;U251/TR細胞MGMT表達水平較未經(jīng)誘導(dǎo)的U251膠質(zhì)瘤細胞明顯增加(P=0.00)。結(jié)論通過分步誘導(dǎo)方法于體外成功建立1株對替莫唑胺耐藥的U251/TR細胞系。MGMT表達水平升高是導(dǎo)致U251/TR細胞對替莫唑胺耐藥的主要機制。

替莫唑胺;神經(jīng)膠質(zhì)瘤;O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶;抗藥性

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma,GBM)是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤,占所有顱內(nèi)腫瘤的12%～15%[1]。臨床上主要采用以手術(shù)治療為主,輔助放射治療、化學治療(化療)及生物治療的綜合方案。高脂溶性、小分子和易于透過血-腦脊液屏障的烷化劑,是目前公認的治療腦膠質(zhì)瘤的標準化療藥物[2]。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)屬于第2代烷化劑化療藥物,為咪唑四嗪類衍生物,口服的生物利用度近100%,不經(jīng)肝臟代謝,能迅速透過血-腦脊液屏障,直接在腦膠質(zhì)瘤組織堿性環(huán)境中分解,生成活性物質(zhì)5-(3-甲基三氮烯-1)咪唑-4-酰胺[5-(3-methyl-triazen1-yl)imidazole-4-carboxomide,MTIC],療效佳,不良反應(yīng)小,目前備受臨床青睞。然而,腫瘤細胞內(nèi)在或獲得性耐藥限制了烷化劑的臨床應(yīng)用效果,目前GBM患者平均生存時間只有12～15個月[1]。迄今多數(shù)研究業(yè)已證實,導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細胞對烷化劑耐藥的機制與O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)表達水平有關(guān)。筆者通過分步誘導(dǎo)法構(gòu)建對TMZ耐藥細胞,檢測其耐藥機制,以期為進一步研究耐藥機制、克服耐藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系來源 GBM細胞系U251,購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所中國科學院細胞庫,穩(wěn)定傳代10代后用于實驗。

1.2 藥品與試劑 TMZ由天津天士力醫(yī)藥公司提供。二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司。噻唑藍(thiazolyl blue,MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司。免疫試劑中Ⅰ抗工作液MGMT小鼠抗人單克隆抗體MT3.1(MAB16200)為Chemicon公司產(chǎn)品,Ⅱ抗工作液中辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(BA1038)由武漢博士德生物工程有限公司提供,小鼠β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；所有抗體工作濃度均為1∶1 000。聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司。實時-聚合酶鏈反應(yīng)(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)相關(guān)試劑購自日本Takara公司,達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)購自北京索萊寶公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)由美國Hyclone公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及細胞耐藥分步誘導(dǎo) GBM細胞U251置于含體積分數(shù)為10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中,于37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱、飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)。TMZ溶于DMSO溶液,儲存液質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1,細胞培養(yǎng)過程中DMSO濃度始終維持＜0.10%,以免影響細胞生長[3]。處于對數(shù)生長期的U251膠質(zhì)瘤細胞制成細胞懸液1×105個·mL-1,常規(guī)培養(yǎng)24h后加入初始誘導(dǎo)劑量的TMZ 0.25 μg·mL-1,繼續(xù)培養(yǎng)15～20 d,待細胞生長穩(wěn)定后倍增藥物誘導(dǎo)濃度,每一誘導(dǎo)濃度培養(yǎng)15～20 d, TMZ終濃度為16.00 μg·mL-1。每個月定時加入16.00 μg·mL-1TMZ溶液培養(yǎng)7 d,使TMZ耐藥細胞系U251/TR的耐藥性保持穩(wěn)定。

1.3.2 MTT法檢測U251膠質(zhì)瘤耐藥細胞(U251/ TR)耐藥指數(shù) 將對數(shù)生長期U251膠質(zhì)瘤耐藥細胞(U251/TR)和U251膠質(zhì)瘤細胞,按照接種濃度為每孔細胞3×103個接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每一濃度設(shè)復(fù)孔6個,培養(yǎng)24 h后分別滴加5,50,100和500 μmol·L-1TMZ溶液[4],繼續(xù)培養(yǎng)72 h；棄上清液,檢測前4 h每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)20 μL,繼續(xù)原條件下培養(yǎng)4 h,棄去上清液,每孔再加入DMSO溶液150 μL以終止反應(yīng),振蕩10 min,經(jīng)Bio-Rad酶標儀檢測每孔在波長570 nm下的吸光度(A)值,以490 nm為參考波長。按照耐藥指數(shù)=半數(shù)抑制濃度(IC50) (U251/TR)/IC50(U251),計算U251/TR細胞耐藥指數(shù)。

1.3.3 Western-Blot法檢測MGMT蛋白表達 選擇對數(shù)生長期的待檢測的U251膠質(zhì)瘤細胞5×106個進行Western-Blot檢測。提取總蛋白后采用二喹啉甲酸法行蛋白濃度測定,上樣量為50 μg,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)膜,膜封閉液室溫封閉3 h后,滴加MGMT小鼠抗人單克隆抗體(Ⅰ抗)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(Ⅱ抗)進行孵育；化學發(fā)光物按照比例(1∶1)混勻、加于聚偏二氟乙烯膜上,X線片適度曝光后進行β-肌動蛋白(β-actin)二次雜交,即70℃水浴洗膜30 min[Tris-HCl(pH 6.8)62.50 mmol·L-1,體積分數(shù)2%SDS,β-巰基乙醇100mmol·L-1],同法,以小鼠βactin單克隆抗體(1∶1 000)孵育后曝光,以β-action作為內(nèi)參照物。采用Alpha Innotech凝膠成像儀檢測結(jié)果,以FluoChem V2.0版軟件計算各條帶的平均A值。每個樣本重復(fù)檢測3次。

1.3.4 RT-PCR檢測 采用Trizol法提取細胞總RNA,用NanoDrop ND-1000進行定量RNA濃度,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。MGMT(Genebank accession no.NM_ 002412)設(shè)計引物,forward,5'-CCTGGGAACAAGCGTGTCT-3'；reverse,5'-CTGGACAGCGGCTATGGC-3',產(chǎn)物236 bp。β-actin PCR引物序列:forward,5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3'；reverse,5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3',產(chǎn)物315 bp。以逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板,在200 μL EP管中按下列順序加入反應(yīng)體系:Master Mix 10 μL,上下游引物混合物1 μL, cDNA溶液,純化水,充分混勻各組分,反應(yīng)體系為20 μL。MGMT反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30 s,52℃退火30s,72℃延伸30 s,40個循環(huán), 72℃總延伸5 min。β-actin反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸30 s, 36個循環(huán),72℃總延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。

1.3.5 免疫熒光檢測 將腫瘤細胞消化成細胞懸液稀釋成約1×104個·mL-1,培養(yǎng)24 h后4%多聚甲醛固定細胞30 min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌后,1%牛血清清蛋白(albumin from bovine serum,BSA)封閉30 min,一抗(1∶1 000稀釋) 4℃過夜,洗滌后,熒光二抗(1∶1 000稀釋)37℃孵育1 h。避光,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染核20 min,封片。熒光倒置顯微鏡下觀察并攝像。

1.3.6 免疫組化檢測 按免疫熒光方式固定細胞,一抗、二抗處理細胞后,滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物溶液,37℃孵育20 min,3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木精復(fù)染,梯度脫水,封片顯微鏡下觀察并攝像。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0版統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,由Probit過程分析TMZ不同濃度梯度與細胞生長抑制率之間的關(guān)系；直線回歸方程計算兩組U251膠質(zhì)瘤細胞各自的半數(shù)抑制濃度(IC50)；兩樣本均數(shù)間的比較行t檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞耐藥性檢測 采用分步誘導(dǎo)法經(jīng)過8個月成功建立對TMZ具有穩(wěn)定耐藥的U251/TR細胞。結(jié)果顯示,TMZ對U251/TR細胞產(chǎn)生作用的劑量-反應(yīng)曲線(圖1)上移,經(jīng)回歸方程計算U251膠質(zhì)瘤細胞IC50為(33.12±1.52)μmol·L-1,U251/TR細胞IC50為(220.87±2.34)μmol·L-1,U251/TR對U251膠質(zhì)瘤細胞的耐藥指數(shù)約為7,即U251/TR細胞對TMZ的耐受程度為U251膠質(zhì)瘤細胞的7倍,二者差異有統(tǒng)計學意義(t=-116.54,P=0.00)。且U251/TR細胞經(jīng)2個月無TMZ體外培養(yǎng)后,采用誘導(dǎo)終濃度進行刺激培養(yǎng)10 d,其耐藥性仍維持5倍,并可于之后的傳代培養(yǎng)過程中保持耐藥性,表明該細胞耐藥性穩(wěn)定。

2.2 U251及U251/TR細胞MGMT表達變化 Western-Blot、RT-PCR檢測結(jié)果顯示,U251膠質(zhì)瘤細胞不表達MGMT或呈低表達,U251/TR細胞MGMT表達水平明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.00,圖2)。檢測U251及U251/TR細胞中MGMT表達情況發(fā)現(xiàn), U251細胞無或弱熒光,而U251/TR細胞質(zhì)呈綠色熒光(圖3)。胞核為DAPI染色,呈藍色；免疫組化法檢測U251及U251/TR細胞中MGMT表達情況發(fā)現(xiàn), U251細胞無著色,而U251/TR細胞呈棕黃色或褐色著色(圖3)。以上結(jié)果說明U251/TR細胞中MGMT表達較U251細胞中明顯增強。

圖1 TMZ對U251細胞和U251/TR細胞的劑量-反應(yīng)曲線Fig.1 Dose-response curve of TMZ on U251 and U251/ TR cells

圖2 Western-Blot和RT-PCR檢測U251細胞和U251/ TR細胞中MGMT的表達Fig.2 MGMT expression in U251 and U251/TR cells by Western-Blot and RT-PCR detection

3 討論

A.U251細胞(免疫熒光法);B.U251/TR細胞(免疫熒光法);C.U251細胞(免疫組化法);D.U251/TR細胞(免疫組化法)圖3 免疫熒光法和免疫組化法對U251細胞和U251/TR細胞中MGMT的檢測結(jié)果(×200)A.U251 cells(immunofluorescence)；B.U251/TR cells(immunofluorescence)；C.U251 cells(immunohistochemistry)；D.U251/TR cells(immunohistochemistry)Fig.3 MGMT expression in U251 and U251/TR cells by immunofluorescence and immunohistochemistry(×200)

雖然目前神經(jīng)外科影像、手術(shù)技術(shù)已經(jīng)得到了長足發(fā)展,但是GBM的治療效果仍不盡如人意?；熥?0世紀80年代開始作為對腦腫瘤的輔助治療手段[5],在延長膠質(zhì)瘤患者生存期方面發(fā)揮了重要作用。GBM的化療藥物一般選擇脂溶性、小分子、易于透過血-腦脊液屏障的細胞毒性藥物,其中,臨床以亞硝脲類藥物最受推崇?？诜榛瘎㏕MZ以其確切的臨床療效,為GBM的化療帶來了希望,但腫瘤細胞內(nèi)在的或獲得的耐藥性限制了藥物的臨床效果,其5年生存率＜9.8%。因此,闡明GBM細胞耐藥機制并探討其逆轉(zhuǎn)方式,將對新藥的研發(fā),逆轉(zhuǎn)耐藥性,改善患者生存狀態(tài),優(yōu)化臨床化療方案等具有重大意義,而耐藥細胞系的建立是進行此類研究的基礎(chǔ)。

在本研究中,筆者通過體外分步誘導(dǎo)的方法使人U251膠質(zhì)瘤細胞暴露于不同濃度的TMZ中,歷經(jīng)8個月,成功地誘導(dǎo)了一株耐藥指數(shù)約為7的耐藥細胞系U251/TR。經(jīng)免疫熒光法、免疫組化法、Western-Blot、RT-PCR對MGMT檢測結(jié)果顯示,U251/TR細胞表達MGMT,而U251膠質(zhì)瘤細胞則不表達或極低表達MGMT(P＜0.01)。根據(jù)腫瘤細胞MGMT是否表達,可將其分為具有MGMT表達的Mer+表型細胞和缺乏表達的Mer-表型細胞[6]。本研究結(jié)果提示,經(jīng)體外傳代培養(yǎng)的U251膠質(zhì)瘤細胞屬于Mer-細胞,對TMZ敏感；而U251/TR細胞為Mer+細胞,對TMZ具有明顯耐藥性。膠質(zhì)瘤細胞對TMZ耐藥的可能機制之一為腫瘤細胞的固有耐藥性所致,如同為膠質(zhì)瘤細胞系中的T98G細胞即MGMT呈高表達,對TMZ耐藥性明顯。U251膠質(zhì)瘤細胞系雖為Mer-細胞,但不排除在其群體中存在少量Mer+細胞,當采用分步給予TMZ時Mer-細胞被殺死,而少量Mer+細胞得以存活,并成為以后耐藥細胞克隆生長的母體。HAMPSON等[7]則認為, MGMT的表達出現(xiàn)不是對Mer-細胞選擇性殺傷的結(jié)果,而是由于在分步誘導(dǎo)下,原來處于表達關(guān)閉狀態(tài)的MGMT基因重新表達的緣故。有學者認為,MGMT基因啟動子區(qū)CpG島的非甲基化是導(dǎo)致MGMT表達的原因[8]。但筆者的研究揭示MGMT基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)與MGMT的表達無相關(guān)性,如腫瘤自身增殖、血管生成、侵襲、免疫調(diào)節(jié)過程中某些因素的改變可能也影響MGMT表達[1]。另外,野生型p53(wild-type p53,wt-p53)蛋白可能對MGMT表達起抑制作用[9]。也有學者持相反觀點認為,突變型p53可能與MGMT表達減少和(或)基因啟動子甲基化有關(guān)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)核因子κB與MGMT表達呈正相關(guān),其調(diào)控機制是獨立于啟動子甲基化的[10-11]。IDBAIH等[12]則認為染色體1p和19q的聯(lián)合缺失(LOH)與MGMT失活相關(guān)。在本研究中,U251膠質(zhì)瘤細胞在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中MGMT表達水平明顯升高,但MGMT蛋白表達的確切調(diào)節(jié)機制尚需進一步研究。

由于TMZ主要通過DNA甲基化對腫瘤細胞產(chǎn)生毒性作用,而MGMT可以去除鳥嘌呤O6位加合的甲基使DNA得以復(fù)原,這一過程將消耗MGMT[6]。因此,在倍增TMZ的藥物濃度后,MGMT可能被不同程度消耗,造成部分腫瘤細胞被殺死或殺傷,而耐藥性強的細胞適應(yīng)后恢復(fù)增殖,向進一步高耐藥水平發(fā)展,所以分階段適度遞增TMZ濃度是細胞順利產(chǎn)生耐藥性的重要環(huán)節(jié),這可能給臨床優(yōu)化化療方案以提示。

本研究結(jié)果提示,通過分步誘導(dǎo)的方法可以成功地建立對TMZ穩(wěn)定耐藥的膠質(zhì)瘤細胞系,MGMT表達升高是膠質(zhì)瘤細胞對TMZ等烷化劑耐藥的主要原因；TMZ耐藥人腦膠質(zhì)瘤細胞系成功建立,將為新藥研發(fā)、耐藥性逆轉(zhuǎn)和臨床藥物化療方案的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。在未來研究中,筆者將進一步研究其耐藥機制、逆轉(zhuǎn)耐藥性方式及如何優(yōu)化臨床化療方案等。

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DOI 10.3870/yydb.2014.09.001

Establishment of a TMZ-resistant Human Glioma Cell Line U251/TR and the Mechanism of Drug-resistance

PAN Qiang1,YANG Xue-jun2,Gao Song3,JI Yan-wei4,ZHANG Wen-gao5
(1.Department of Neurosurgery, People's Hospital of Laiwu City,Laiwu Hospital Affilliated to Taishan Medical College,Laiwu 271100,China; 2.Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;3. Department of Pancreatic Neoplasms,Cancer Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300060,China;4. Department ofNeurosurgery,ShandongJiaotongHospital,Jinan250031,China;5.Departmentof Neurosurgery,Cangzhou Central Hospital of Hebei Province,Cangzhou 061001,China)

Objective To establish a drug-resistance cell line of human glioma with temozolomide(TMZ),investigate its resistance mechanisms,and provide experimental evidence for optimal TMZ therapy.MethodsA TMZ-resistant human glioma cell line,U251/TR,was established by stepwise exposure of human parental U251 cells to TMZ.Resistance index and cell viability were accessed by MTT assay.Western-Blot,RT-PCR,immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect MGMT expression for the analysis of resistance mechanism.ResultsA TMZ-resistant human glioma cell line,U251/TR,was developed after 8 months of stepwise induction with 0.25-16.00 μg·mL-1TMZ.IC50in U251/TR cells was approximately 7 times higher compared with that in U251 cells(P=0.00).The MGMT expression was significantly increased in U251/TR cells compared with that in parental U251 cells(P=0.00).ConclusionA TMZ-resistant human glioma cell line,U251/TR,was established by stepwise exposure of human parental U251 cells to TMZ.The primary mechanism of TMZ resistance is associated with increased activity of MGMT.

Temozolomide;Glioma;O6-methylguanine-DNA methyltransferase;Drug-resistance

R979.1；R969

A

1004-0781(2014)09-1121-05

2013-09-09

2013-11-09

*國家自然科學基金資助項目(30772228)

潘強(1980-),男,山東萊蕪人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:神經(jīng)上皮來源腫瘤。電話:(0)13561724411,E-mail:pqianglin@163.com。

楊學軍(1965-),男,天津人,教授,博士生導(dǎo)師,博士,研究方向:神經(jīng)上皮來源腫瘤。電話:(0) 13011329950,E-mail:ydenny@yahoo.com。