申紅遠(yuǎn)，白 靜，湯 喆，梁 偉，馬清華，劉秀華，王 禹*

（解放軍總醫(yī)院：1老年心血管病研究所，4病理生理研究室，北京 100853；2解放軍第324醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400020；3臨沂市沂水中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，臨沂 276400）

血管鈣化在糖尿病和尿毒癥患者中十分常見，與心肌梗死、血管順應(yīng)性下降、血管成形術(shù)時夾層形成有關(guān)，血管鈣化也被認(rèn)為是心血管疾病的重要危險因素之一[1,2]。鈣化的血管對血管舒張劑抵抗，比正常血管更加僵硬，更容易導(dǎo)致血栓形成和動脈粥樣硬化斑塊破裂。最近的研究表明，血管鈣化不是一個被動的、血管疾病終末期、退行性變的表現(xiàn)，是一個主動的受到精確調(diào)控的過程，和骨生成極為相似[3]。血管鈣化是在多種刺激因素下血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化（transformation）的過程[4]。VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation）后堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性增加，基質(zhì)小泡形成，表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs），例如BMP2，以及骨基質(zhì)蛋白，如骨鈣素（osteocalcin bone Gla protein，BGP）、骨連蛋白（osteonectin）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein）[1]。高糖刺激可以引起VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，引起成骨樣細(xì)胞標(biāo)志性分子核心轉(zhuǎn)染因子（Cbfα-1）和BGP表達(dá)升高，ALP活性增加[5]。高糖和葡萄糖代謝產(chǎn)物葡萄糖胺可以引起血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，與動脈粥樣硬化形成有關(guān)[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），UPR包括IRE1α、XBP1和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）途徑[7]。VSMCs向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制還未完全闡明，本實(shí)驗(yàn)旨在揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑是否在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

低糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco），優(yōu)質(zhì)胎牛血清（PPA），D-Hanks液（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶、D-葡萄糖、D-甘露醇（Amresco公司），抗Cbfα-1抗體、抗p-PERK抗體、抗GRP78、抗BGP抗體購自（Santa Cruz公司），抗PERK抗體、抗eIF2α抗體、抗p-eIF2α抗體、抗ATF4抗體（CST公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗（北京中彬金橋生物科技有限公司），ALP活性檢測試劑盒（南京建成生物公司），PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

植塊法進(jìn)行大鼠胸主動脈VSMCs培養(yǎng)，方法簡述如下：健康雄性SD大鼠100g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。乙醚吸入麻醉，頸椎脫臼處死，無菌條件下迅速取出胸主動脈，立即移入有冰的含有無菌D-Hanks液的平皿中。剝離血管外的纖維脂肪組織，去除血管腔的血污，移入另一有冰的無菌D-Hanks液的平皿中，縱向剪開血管，用眼科彎鑷鈍頭輕刮血管腔內(nèi)膜面，分離血管中層平滑肌細(xì)胞，移入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將中膜剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，將組織塊轉(zhuǎn)移入25cm2塑料培養(yǎng)瓶瓶底，培養(yǎng)瓶預(yù)先用少許胎牛血清潤濕包被，組織塊擺置均勻，間距0.2～0.5cm翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使瓶底朝上，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加2～3ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，擰松培養(yǎng)瓶蓋，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中4～6h（如組織貼壁不牢可延長時間），待組織塊與瓶底貼附后，再次翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，注意操作輕柔，使培養(yǎng)液輕輕漫過組織塊，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱，絕對靜止培養(yǎng)5d，一般在5～7d見有細(xì)胞從組織塊邊緣長出，以后每3d換液1次。約2周組織塊周圍可爬滿細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到80%融合時即可傳代，0.125%胰酶（含EDTA）消化、傳代，取4～8代細(xì)胞用作實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)的VSMCs傳至第2代時，用α平滑肌抗體（α-smooth muscle antibody，α-SMA）作為標(biāo)志分子進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。

實(shí)驗(yàn)前24h更換無血清的DMEM培養(yǎng)基，VSMCs隨機(jī)分為5組：（1）正常對照組（5mmol/L D-葡萄糖），細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48或72h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；（2）甘露醇組（5mmol/L D-葡萄糖＋25mmol/L甘露醇），細(xì)胞培養(yǎng)48或72h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；（3）高糖組（30mmol/L D-葡萄糖），高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48或72h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；（4）高糖＋PERK-小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染組（30mmol/L D-葡萄糖＋PERK-siRNA轉(zhuǎn)染），轉(zhuǎn)染前換OpitMEM培養(yǎng)液，采用Lipo2000陽離子脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4～6h后換高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48或72h至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；（5）高糖＋RNA干擾陰性對照組[30mmol/L D-葡萄糖＋亂序（scramble）RNA轉(zhuǎn)染]，將PERK-siRNA換為亂序RNA，余同組（4）。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）

采用TRIzol-A＋提取總RNA，Thermo NanoDrop 2 000分光光度計測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的18S條帶。按VigoScript第一鏈互補(bǔ)DNA（cDNA）合成試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各目的基因上下游引物（P1，P2）見表1。PCR產(chǎn)物電泳圖像采用Image-Pro Plus4.1圖像分析軟件分析平均吸光度值，以目的片段和18S平均吸光度值的比值表示目的基因信使RNA（mRNA）的相對水平。

1.4 Western blot

收取各組第48和72小時細(xì)胞，采用RIPA蛋白提取液提取平滑肌細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量后分裝，-80℃保存。各組樣品蛋白上樣量為80μg，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，相對分子質(zhì)量＞90ku為10%分離膠，而＜90ku為12%分離膠）。電轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維膜上，5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉40min后分別加入抗GRP78、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、Runx2、α-SMA多克隆抗體（均為1∶500）、抗PERK多克隆抗體（1∶1000）4℃孵育雜交過夜，用1×TBS-T洗膜后以相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1h，以GAPDH（1∶1000）單克隆抗體重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，作為上樣對照及內(nèi)參照?？乖?抗體復(fù)合物用ECL法顯示，暗室X線膠片曝光，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的平均吸光度值，以目標(biāo)蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值反映目標(biāo)蛋白相對水平。

1.5 ALP活性檢測

ALP活性檢測試劑盒測定ALP活性。各組細(xì)胞干預(yù)48和72h結(jié)束后，收集細(xì)胞用冷PBS洗3次，加入150μl/孔（24孔板）0.05%的TritonX-100，超聲波破碎細(xì)胞10s，收集懸液，4℃12 000×g離心15min，上清即為待測樣本，蛋白用BCA法定量，各樣本按照說明書分別加入反應(yīng)試劑，紫外分光光度計測520nm處的吸光度值，將計算出的數(shù)值除以該樣品的蛋白含量，得到各樣本單位蛋白中ALP的活性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行多組間比較，多個樣本均數(shù)兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PCR反應(yīng)目的片段引物Table 1 Primer sequence for PCR

2 結(jié) 果

2.1 VSMCs原代培養(yǎng)及其鑒定

VSMCs原代培養(yǎng)及其鑒定結(jié)果如圖1所示。

2.2 PERK-siRNA在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用

2.2.1 各組VSMCs Cbfα-1，ALP，BGP，α-SMA mRNA的表達(dá)變化 PCR結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，Cbfα-1、ALP、BGP mRNA表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，Cbfα-1，ALP，BGP mRNA表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖2～圖4）。各組間α-SMA mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖5）。

圖1 血管平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及其鑒定Figure 1 Primary culture and identification of vascular smooth muscle cells

圖2 各組細(xì)胞作用不同時間Cbfα-1，ALP，BGP和α-SMA mRNA的表達(dá)情況Figure 2 Expression of Cbfα-1, ALP, BGP and α-SMA mRNA in five groups at different time points

圖3 各組細(xì)胞作用不同時間Cbfα-1 mRNA的表達(dá)情況Figure 3 Expression of Cbfα-1 mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖4 各組細(xì)胞作用不同時間ALP mRNA和BGP mRNA的表達(dá)情況Figure 4 Expression of ALP mRNA and BGP mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖5 各組細(xì)胞作用不同時間α-SMA mRNA的表達(dá)情況Figure 5 Expression of α-SMA mRNA in five groups at different time points(n＝3)

2.2.2 各組VSMCs Cbfα-1和α-SMA表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，Cbfα-1蛋白表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，Cbfα-1蛋白表達(dá)降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖6，圖7）。而α-SMA蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖8）。

2.3 PERK-siRNA在高糖誘導(dǎo)引起VSMCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2.3.1 各組VSMCs GRP78，PERK，eIF2α，ATF4 mRNA的表達(dá)變化 PCR結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，GRP78，PERK，eIF2α和ATF4 mRNA表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，GRP78，PERK，eIF2α和ATF4 mRNA表達(dá)降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖9～圖13）。

2.3.2 各組VSMCs GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α，ATF4蛋白水平表達(dá)的變化 PCR結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α和ATF4蛋白表達(dá)升高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋PERK-siRNA組相對于高糖組和高糖＋亂序RNA組，GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α和ATF4蛋白表達(dá)降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖14～圖16，圖17～圖20）。

圖6 各組細(xì)胞作用不同時間Cbfα-1和α-SMA蛋白的表達(dá)情況Figure 6 Expression of Cbfα-1 and α-SMA protein in five groups at different time points

圖7 各組細(xì)胞作用不同時間Cbfα-1蛋白的表達(dá)情況Figure 7 Expression of Cbfα-1 protein in five groups at different time points(n＝3)

圖8 各組細(xì)胞作用不同時間α-SMA蛋白的表達(dá)情況Figure 8 Expression of α-SMA protein in five groups at different time points(n＝3)

圖9 各組細(xì)胞作用不同時間GRP78，PERK，eIF2α和ATF4 mRNA的表達(dá)情況Figure 9 Expression of GRP78, PERK, eIF2α and ATF4 mRNA in five groups at different time points

圖10 各組細(xì)胞作用不同時間PERK mRNA的表達(dá)情況Figure 10 Expression of PERK mRNA in five groups at different time points(n＝3)

2.4 各組VSMCs ALP活性檢測

ALP檢測結(jié)果顯示，高糖處理后，相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，ALP活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高糖＋亂序RNA相對于正常對照組、甘露醇組和高糖＋PERK-siRNA組，ALP活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；表2）。

圖11 各組細(xì)胞作用不同時間GRP78 mRNA的表達(dá)情況Figure 11 Expression of GRP78 mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖12 各組細(xì)胞作用不同時間eIF2α mRNA的表達(dá)情況Table 12 Expression of eIF2α mRNA in five groups at different time points (n＝3)

3 討 論

血管鈣化是鈣鹽沉積在血管壁的一個主動的過程，和骨形成有許多相似之處。VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換在血管鈣化中發(fā)揮重要作用，VSMCs的成骨樣細(xì)胞表型一經(jīng)形成，鈣化促進(jìn)因子Cbfα-1就會在血管平滑肌表達(dá)升高，Cbfα-1是成骨細(xì)胞標(biāo)志性分子，其出現(xiàn)也標(biāo)志著血管鈣化的起始步驟[8]。血管鈣化也和抑制血管鈣化的因子減少有關(guān)，這些因子包括：無機(jī)焦磷酸鹽、基質(zhì)Gla蛋白、骨橋蛋白、骨保護(hù)素、胎球蛋白、Smad6等[8]。

圖13 各組細(xì)胞作用不同時間ATF4 mRNA的表達(dá)情況Table 13 Expression of ATF4 mRNA in five groups at different time points(n＝3)

圖14 各組細(xì)胞作用不同時間GRP78，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α和ATF4蛋白的表達(dá)情況Figure 14 Expression of GRP78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α and ATF4 protein in five groups at different time points

圖15 各組細(xì)胞作用不同時間PERK蛋白的表達(dá)情況Figure 15 Expression of PERK protein in five groups at different time points(n＝3)

圖16 各組細(xì)胞作用不同時間GRP78蛋白的表達(dá)情況Figure 16 Expression of GRP78 protein in five groups at different time points(n＝3)

許多刺激因素可以導(dǎo)致VSMCs轉(zhuǎn)分化，如高糖、糖基化終末產(chǎn)物、高磷、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、硬脂酸鹽、氧化應(yīng)激、氧化低密度脂蛋白、維生素D等[1,9?11]。本研究中發(fā)現(xiàn)高糖刺激可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑使VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，VSMCs表達(dá)成骨樣細(xì)胞標(biāo)志物Cbfα-1，BGP，ALP升高，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK分子在發(fā)育過程中扮演重要角色，其功能缺失突變在人和小鼠會導(dǎo)致新生個體發(fā)育缺陷，如糖尿病、生長遲滯和多部位骨骼發(fā)育異常[12,13]。體外研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑在骨組織和骨細(xì)胞發(fā)育成熟中起重要作用[14]。

在體外培養(yǎng)和一些心血管病理生理過程中，VSMCs會經(jīng)歷表型轉(zhuǎn)化。它們與其他肌細(xì)胞不同，是一種非終末分化細(xì)胞[14]。VSMCs是由間胚層分化發(fā)育而來，對于血管的收縮和舒張有著十分重要的作用。Cbfα-1又稱為Runx2，是成骨細(xì)胞發(fā)育分化的掌控因子，在骨形成中起關(guān)鍵作用，其在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)升高被認(rèn)為是向成骨樣細(xì)胞分化的明確的早期標(biāo)志[15]。Cbfα-1控制著其下游與成骨細(xì)胞發(fā)育分化有關(guān)的蛋白分子，如BGP、骨橋蛋白（osteopontin）和Ⅰ型膠原[16]。

圖17 各組細(xì)胞作用不同時間eIF2α蛋白的表達(dá)情況Table 17 Expression of eIF2α protein in five groups at different time points(n＝3)

圖18 各組細(xì)胞作用不同時間ATF4蛋白的表達(dá)情況Table 18 Expression of ATF4 protein in five groups at different time points(n＝3)

圖19 各組細(xì)胞作用不同時間p-PERK蛋白的表達(dá)情況Table 19 Expression of p-PERK protein in five groups at different time points (n＝3)

圖20 各組細(xì)胞作用不同時間p-eIF2α蛋白的表達(dá)情況Table 20 Expression of p-eIF2α protein in five groups at different time points(n＝3)

本實(shí)驗(yàn)中我們用RNA干擾（RNA intenference，RNAi）技術(shù)干擾PERK的表達(dá)，成功地使其在高糖環(huán)境刺激下mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)降低，其激活形式——磷酸化的PERK也降低，同時其下游eIF2α在mRNA和蛋白水平也降低，磷酸化的eIF2α表達(dá)也下降，成骨樣細(xì)胞的標(biāo)志物Cbfα-1和BGP表達(dá)下降，ALP mRNA表達(dá)也下降。VSMCs在高糖刺激下，PERK-siRNA干預(yù)后其ALP活性下降。作為陰性對照的亂序RNA處理組同高糖組相比未見明顯差異。甘露醇組和正常對照組相比，未引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑表達(dá)改變，也未見成骨樣細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)變化。

表2 各組細(xì)胞作用不同時間ALP活性檢測Table 2 The activity test of ALP in five groups at different time points(n＝3, U/g protein, ±s)

表2 各組細(xì)胞作用不同時間ALP活性檢測Table 2 The activity test of ALP in five groups at different time points(n＝3, U/g protein, ±s)

CON: normal control group; Mannitol: mannitol group; HG: high glucose group; HG＋PERK-siRNA: high glucose＋PERK-siRNA group; HG＋scramble RNA: high glucose＋scramble RNA group.Compared with CON, Mannitol, HG＋PERKsiRNA groups, *P＜0.05;compared with HG, HG＋scramble RNA groups, #P＜0.05

Group 48h 72h CON 72.00±3.62 75.00±3.35 Mannitol 70.00±3.91 72.00±3.78 HG 99.00±6.23* 113.00±5.79*HG＋PERK-siRNA 69.00±4.34# 83.00±4.45#HG＋scramble-RNA 99.00±6.25* 110.00±5.92*

血管鈣化的確切機(jī)制目前仍不十分清楚，但迄今認(rèn)為其不是一個被動的鈣鹽沉積的過程，而是一個主動的、和骨形成有許多形似之處的可調(diào)控的過程。VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化這一細(xì)胞學(xué)行為在血管鈣化的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。血管鈣化的關(guān)鍵問題是VSMCs由收縮表型向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，而細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是細(xì)胞生物學(xué)的重大科學(xué)問題[17]。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)敲低PERK，成功闡明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK途徑在高糖誘導(dǎo)VSMCs向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中發(fā)揮作用，并且干預(yù)PERK可以抑制這一轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞生物學(xué)過程，有助于對血管鈣化這一病理生理現(xiàn)象進(jìn)行干預(yù)，可以作為血管鈣化早期預(yù)防的靶點(diǎn)。

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