楊瀚春,王榮,何家田,夏鵬霄,謝華

(1.解放軍第513醫(yī)院藥劑科,甘肅東風(fēng) 732750;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍臨床藥理基地,蘭州 730050;3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,蘭州 730000;4.蘭州軍區(qū)藥品儀器檢驗(yàn)所,蘭州 730050)

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定鎖陽(yáng)中3種有效成分

楊瀚春1,王榮2,3,何家田4,夏鵬霄1,謝華2

(1.解放軍第513醫(yī)院藥劑科,甘肅東風(fēng) 732750;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍臨床藥理基地,蘭州 730050;3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院,蘭州 730000;4.蘭州軍區(qū)藥品儀器檢驗(yàn)所,蘭州 730050)

目的 建立同時(shí)測(cè)定鎖陽(yáng)中兒茶素(CA)、沒食子酸(GA)、原兒茶酸(PR)的高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法。方法以鎖陽(yáng)中CA、GA、PR為考察指標(biāo),建立CA、GA、PR間的相對(duì)校正因子,并用校正因子計(jì)算CA、GA、PR的含量,將一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較。結(jié)果建立了鎖陽(yáng)中3種成分的一測(cè)多評(píng)法;一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論同時(shí)測(cè)定鎖陽(yáng)中CA、GA、PR等3種成分的一測(cè)多評(píng)法方法可靠,結(jié)果準(zhǔn)確,可用于控制鎖陽(yáng)藥材及飲片的質(zhì)量。

鎖陽(yáng);兒茶素;沒食子酸;原兒茶酸;一測(cè)多評(píng)法

鎖陽(yáng)亦稱不老藥,又名銹鐵棒、地毛球、羊鎖不拉,為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉質(zhì)莖[1]。鎖陽(yáng)中含有的兒茶素(catechin,CA)具有提高免疫功能、抗氧化等活性,沒食子酸(gallic acid,GA)具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用;原兒茶酸(protocatechic acid,PR)具有增加冠狀動(dòng)脈血流量、降低心肌耗氧量的作用,在體外具有明顯抑制血小板聚集的活性和抗菌活性[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定CA、GA、PR的含量,并利用以上3種成分內(nèi)在的函數(shù)和比例關(guān)系,采用一測(cè)多評(píng)的方法[4-5],計(jì)算CA、GA、PR相互之間的相對(duì)校正因子(f)和3種成分的含量,為客觀評(píng)價(jià)鎖陽(yáng)及其中成藥的質(zhì)量提供了新的分析模式。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀,Waters 996二極管矩陣檢測(cè)器,Millennium32色譜工作站(美國(guó)Waters);十萬(wàn)分之一電子天平(Metter AE240型);超聲波提取器(SK5200H,上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);離心機(jī)(Anke TGL-16B,上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥 CA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110877-200001)、GA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110831-200302)、PR對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110809-200503),均供含量測(cè)定用,純度均≥98%;乙腈為色譜純(天津四友);水為滅菌注射用水;其余試劑均為分析純。鎖陽(yáng)藥材及飲片來(lái)源:東風(fēng)場(chǎng)區(qū)(飲片)由楊瀚春采挖并切制,東風(fēng)場(chǎng)區(qū)藥材由夏鵬霄采挖,甘肅金塔藥材由當(dāng)采挖,內(nèi)蒙古古日乃和內(nèi)蒙古額濟(jì)納旗藥材由當(dāng)?shù)夭赏?烏魯木齊(飲片)購(gòu)自當(dāng)?shù)厮幍?蘭州(飲片)取自蘭州軍區(qū)決醫(yī)院藥房。均由蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志鋼教授鑒定為Cynomorium songaricum Rupr.。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18柱(4.6 mm× 250 mm,2.5 μm);流動(dòng)相:乙腈∶水∶36%乙酸(8∶92∶0.1);流速:1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為258.7 nm;柱溫:室溫;進(jìn)樣量:20 μL。理論板數(shù)按CA峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取CA、GA、PR對(duì)照品適量精密稱定,置于同一個(gè)10 mL量瓶中,加滅菌注射用水適量,超聲10 min,加水至刻度,配制成含CA 0.118 mg·mL-1、GA0.126mg·mL-1、PR 0.147 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取鎖陽(yáng)粉末[過(guò)篩孔內(nèi)徑0.425 mm(40目)篩)]約1.0 g,精密稱定,置50 mL量瓶,精密加入滅菌注射用水20 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,離心,上清液用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過(guò),置棕色瓶中,即得。取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定。結(jié)果見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2 mL,分別置5 mL量瓶中,加水稀釋至刻度,依次取稀釋后的混合對(duì)照品溶液及未稀釋的混合對(duì)照品溶液各20 μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸處理。結(jié)果表明, CA在0.047 2～1.510 0 μg范圍內(nèi)、GA在0.050 4～1.610 0 μg范圍內(nèi)、PR在0.058 8～1.880 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好?；貧w方程:兒茶素Y=82 466.81X+ 281.83,r=0.999 9、沒食子酸Y=886 294.46X+ 1 485.33,r=0.999 6,原兒茶酸Y=2 136 116.67X+ 5 884.29,r=0.999 8。

圖1 對(duì)照品(A)與樣品(B)HPLC色譜圖

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次(每次20 μL),樣品峰面積積分值的日內(nèi)RSD分別CA 3.67%、GA 3.47%、PR 2.19%;日間RSD分別為CA 4.24%、GA 3.89%、PR 3.08%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液,在24 h內(nèi)按擬定的時(shí)間間隔重復(fù)進(jìn)樣8次,每次進(jìn)樣20 μL,樣品中3種成分的平均含量分別為CA 4.176 8 mg·g-1, RSD為4.84%;GA 0.672 1 mg·g-1,RSD為4.10%;PR 0.131 5 mg·g-1,RSD為4.32%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品(甘肅金塔)6份,精密稱定,分別按“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備成6份樣品液,進(jìn)樣,分析,結(jié)果平均含量CA為4.174 0 mg·g-1, RSD為4.18%;GA為0.672 1 mg·g-1,RSD為3.99%;PR為0.131 2 mg·g-1,RSD為4.14%。說(shuō)明本法的重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)定含量的鎖陽(yáng)樣品(甘肅金塔)6份精密稱定,分別加入相應(yīng)量的對(duì)照品,按“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法操作,進(jìn)樣20 μL,測(cè)得CA的平均回收率為100.6%,RSD為3.35%;GA的平均回收率為101.2%,RSD為2.36%;PR的平均回收率為97.90%,RSD為3.14%。

2.9 相對(duì)校正因子的計(jì)算 分別以CA、GA、PR為內(nèi)參物,根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算公式[4],分別計(jì)算各待評(píng)價(jià)成分與內(nèi)參物的相對(duì)校正因子,見表1～3。

2.10 色譜峰定位 “一測(cè)多評(píng)”法色譜峰的準(zhǔn)確定位一般可以采用保留時(shí)間差或相對(duì)保留值等參數(shù)結(jié)合色譜圖整體特征,以及每個(gè)峰的紫外吸收特征來(lái)定位其余待測(cè)成分(a,b,…,i,…)色譜峰[6]。相對(duì)保留值指各待測(cè)成分與內(nèi)參物s間保留時(shí)間的比值,計(jì)算公式:ras=tRa/tRs;保留時(shí)間差指各待測(cè)成分與內(nèi)參物S間保留時(shí)間的差值,計(jì)算公式:ΔtRas=tRa-tRs。

表1 以CA為內(nèi)參物的相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果(n=2)

表2 以GA為內(nèi)參物的相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果(n=2)

表3 以PR為內(nèi)參物的相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果(n=2)

本研究分別考察相對(duì)保留值和保留時(shí)間差的重復(fù)性。結(jié)果表明保留時(shí)間差有一定的波動(dòng),RSD介于3%～4%;相對(duì)保留值的波動(dòng)相對(duì)較小,RSD＜1%,因此采用相對(duì)保留值進(jìn)行鎖陽(yáng)中CA、GA、PR等成分色譜峰的定位較為可行。見表4～6。

表4 以CA為內(nèi)參物的相對(duì)保留值(n=2)

表5 以GA為內(nèi)參物的相對(duì)保留值(n=2)

2.11 樣品測(cè)定 分別取各批藥材制備供試品溶液。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL,高效液相色譜儀進(jìn)樣測(cè)定。分別采用外標(biāo)法和“一測(cè)多評(píng)”法計(jì)算鎖陽(yáng)中CA、GA、PR的含量,結(jié)果見表7～9。采用“一測(cè)多評(píng)”法及外標(biāo)法所測(cè)得的鎖陽(yáng)中CA、GA、PR的含量基本一致,表明“一測(cè)多評(píng)”法可用于鎖陽(yáng)藥材中CA、GA、PR的含量測(cè)定。

表6 以PR為內(nèi)參物的相對(duì)保留值(n=2)

3 討論

由表1～6可見,以不同的進(jìn)樣量測(cè)得的3種成分間的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留值變異不大;由表7～9可見,“一測(cè)多評(píng)”法與外標(biāo)法測(cè)得的結(jié)果非常接近,表明“一測(cè)多評(píng)”法可以用于中藥多種成分的質(zhì)量控制。由表9可以看出,由于藥材中PR和CA的含量相差較大,并且PR和CA回歸方程的截距相差較大,致使以PR為內(nèi)參物計(jì)算樣品含量時(shí),藥材中以外標(biāo)法和QAMS法測(cè)定的CA含量的相對(duì)偏差偏大。因此,在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)精度,使多個(gè)回歸方程的截距相近。

表7 以CA為內(nèi)參物計(jì)算樣品含量(n=2) mg·g-1

表8 以GA為內(nèi)參物計(jì)算樣品含量(n=2) mg·g-1

表9 以PR為內(nèi)參物計(jì)算樣品含量(n=2)

以CA、GA、PR等3種成分分別為內(nèi)標(biāo)計(jì)算相互間的相對(duì)校正因子和相對(duì)保留值,能夠更好地體現(xiàn)“一測(cè)多評(píng)”法的優(yōu)勢(shì),即只要得到這3種對(duì)照品中的任何一種,就可以同時(shí)測(cè)定這3種成分的含量。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊(cè))[M].上海:上海人民出版社,1997:2395.

[2] 陶晶,屠鵬飛,徐文豪,等.鎖陽(yáng)莖的化學(xué)成分及其藥理活性研究[J].中國(guó)中藥雜志,1999,24(5):36-38,62.

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DOI 10.3870/yydb.2014.07.032

R286;R927.1

A

1004-0781(2014)07-0952-04

2013-06-07

2013-07-22

楊瀚春(1970-),男,甘肅金塔人,副主任藥師,學(xué)士,主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。電話:0937-2461618,E-mail: yhanchun@163.com。