王鑫昱，陳紅梅，吳敏

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院中藥房，杭州 310006)

無比山藥丸中山茱萸和五味子具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗休克、保護肝臟、降血糖和調(diào)節(jié)人體免疫力等作用［1-10］，無比山藥丸主要活性成分為腺苷、馬錢苷、五味子醇甲等。對于該制劑，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》第九分冊，但僅有理化鑒別，無含量檢測。為了更好地控制該制劑質(zhì)量，筆者在本實驗中建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時對上述3種活性成分進行含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HP-1100美國Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Agilent 1100系列柱溫箱;Agilent 1100可變波長檢測器;Aglient 1100系列泵系統(tǒng);pa2251電子分析天平(德國賽多利斯);Centrifuge 5430R型高速離心機(USA，Eppendorf);4020P超聲波清洗器(Korea，JAC Company)。

1.2 試藥 腺苷、馬錢苷和五味子醇甲對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110879-200202，111640-201005，110857-200709，使用前用五氧化二磷干燥12 h，均按照100%計算，含量分別為8.92 mg，10.11 mg，6.13 mg);無比山藥丸(杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，每丸9 g，批號:120911，121032和130104);甲醇為色譜純;水為Mili-Q純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax-C18柱(4.6mm ×250mm，5 μm);流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸溶液，流速為1.0mL·min－1;檢測波長254 nm;柱溫:35℃;梯度洗脫條件:0～15min，8%A;15～26min，25%A;26 ～40min，70%A。

2.2 混合對照品溶液的配制 分別取五氧化二磷為干燥劑減壓干燥12 h以上的腺苷、馬錢苷和五味子醇甲對照品適量，精密稱定，置量瓶中，用50%甲醇定容成濃度分別為 0.603，0.575，0.081 5 mg·mL－1對照品儲備液，分別精密量取各儲備液1.0，1.0和2.0mL至10mL量瓶，以50%甲醇定容至刻度即得。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品15丸(批號:120911)，研細，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密量取50%甲醇50mL，稱定質(zhì)量后，超聲處理40min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足失重，搖勻，高速離心10min，取上清液作為供試品液。

2.4 陰性對照溶液的制備 按照無比山藥丸處方，取除山茱萸和五味子兩味藥材之外的其他藥材適量，按藥品標(biāo)準(zhǔn)中“制法”項下進行制備，得不含山茱萸和五味子成分的陰性對照溶液，再按“2.3”項下制備，得陰性對照品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品混合液1，2，5，10，15，20，30 μL，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進樣分析，測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以進樣量(μg)為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程見表1。結(jié)果表明，腺苷、馬錢苷和五味子醇甲在各自的線性范圍內(nèi)，其峰面積積分與進樣量呈良好的線性關(guān)系。

表1 3種活性成分回歸方程和線性范圍

2.6 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，分別測得腺苷、馬錢苷和五味子醇甲的峰面積積分值，以峰面積積分值計算3種活性成分的RSD(n=6)，分別為 0.4%，0.1% 和 0.7%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液(批號:120911)，分別在 0，2，4，8，12，16，24 h 進樣，記錄峰面積積分值，測得腺苷、馬錢苷和五味子醇甲峰面積的RSD 分別為1.1%，1.6%和1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批號供試品(批號:120911)，按供試品溶液制備方法(“2.3”項)同法制得6份供試品溶液，各進樣10 μL，根據(jù)供試品中腺苷、馬錢苷和五味子醇甲各自的峰面積值，計算得到3種活性成分各自的RSD值，依次為1.2%，1.5%和1.3%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性較好(圖1)。

圖1 陰性對照品(A)、混合對照品(B)和無比山藥丸樣品(C)的RP-HPLC圖譜

2.9 加樣回收率實驗 取已知含量的同一批供試品15丸，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入各對照品儲備液適量，按“2.3”項供試品溶液制備方法操作，同法制得6份供試品溶液。按“2.1”項條件方法進行測定，根據(jù)測得的峰面積積分值分別計算腺苷、馬錢苷和五味子醇甲的回收率。計算得平均加樣回收率分別為98.44%，98.84%和96.79%，RSD分別為1.2%，2.0%和1.7%，結(jié)果表明本方法的加樣回收率較好，符合方法學(xué)要求(表2)。

2.10 樣品含量測定 利用本實驗建立的RP-HPLC方法，測定同一廠家3個不同批號的無比山藥丸。以外標(biāo)法計算樣品中腺苷、馬錢苷和五味子醇甲的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 樣品前處理方法的選擇 在選擇提取方法時，考察了提取溶劑(甲醇、50%甲醇、水)，提取方式(超聲、回流)以及提取時間(30，40，50min)對提取效率的影響。結(jié)果表明，50%甲醇超聲提取40min為最優(yōu)提取方案。

表2 腺苷、馬錢苷、五味子醇甲加樣回收率實驗結(jié)果mg

表3 無比山藥丸3批樣品含量測定結(jié)果 mg·g－1

3.2 流動相的選擇 實驗前分別考察了以甲醇-磷酸、甲醇-水、乙腈-磷酸和乙腈水作為流動相的分離效果，結(jié)果顯示以甲醇-水溶液為流動相的峰形無重疊，分離度較好。在綜合考慮峰形、拖尾因子、保留時間、理塔板數(shù)等因素，最終選擇甲醇-磷酸溶液進行梯度洗脫。

3.3 色譜柱和柱溫的選擇 在色譜柱選擇方面，分別比較了 Eclipse-C18、Extend-C18、Zorbax SB-C18、Hypersil-C18、Kromasil 100-5C18和 Welch Material XB-C18柱對峰形、保留時間的影響，同時還考察柱溫分別在25，35和45℃時，3種色譜峰的分離效果。結(jié)果表明，Zorbox SB-C18柱的分離效果最好，柱溫35℃為佳。

在本法的色譜條件下，無比山藥丸中3種活性成分得到較好分離。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法快速簡便，精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可用于無比山藥丸中腺苷、馬錢苷和五味子醇甲的定量分析，為該藥的質(zhì)量控制提供了一種良好的監(jiān)測方法。

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