劉輝,鄒清河,吳迪,3

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北省宜都市第一醫(yī)院藥劑科,宜都 443300;3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2010級研究生班,武漢 430065)

O-羧甲基殼聚糖復(fù)凝止血海綿的體外表征與止血作用*

劉輝1,鄒清河2,吳迪1,3

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北省宜都市第一醫(yī)院藥劑科,宜都 443300;3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2010級研究生班,武漢 430065)

目的 研究自制O-羧甲基殼聚糖復(fù)凝止血海綿的理化性質(zhì),并考察其止血效果。方法采用冷凍干燥技術(shù)制備O-羧甲基殼聚糖復(fù)凝止血海綿。通過觀察外部形態(tài),測定孔隙率、吸水率、密度等指標(biāo),表征止血海綿的理化性質(zhì);比較O-羧甲基殼聚糖止血海綿和市售吸收性明膠海綿對兔耳動、靜脈創(chuàng)傷出血模型的止血效果。結(jié)果O-羧甲基殼聚糖復(fù)凝止血海綿呈類白色,疏松多孔,具有一定的韌性,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)均勻;孔隙率為67.23%,吸水率為38.77%,密度為0.043 4 g·(cm3)-1;該止血海綿的止血時(shí)間和出血量均低于市售吸收性明膠海綿,且無續(xù)發(fā)性再出血現(xiàn)象。結(jié)論該O-羧甲基殼聚糖復(fù)凝止血海綿理化性質(zhì)穩(wěn)定,止血效果可靠。

O-羧甲基殼聚糖;復(fù)凝止血海綿;體外表征;止血作用

殼聚糖具有顯著的止血功效,無毒,生物相容性良好,可生物降解[1],在止血領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。由于殼聚糖水溶性不佳,僅能溶于酸性溶液,極大地限制了其應(yīng)用范圍。筆者通過在殼聚糖C-6位上引入羧甲基功能基團(tuán),合成了具有特定取代度(44.53%)和脫乙酰度(0.64)的O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl chitosan,O-CMC)[2],不僅改善了殼聚糖在水中的溶解性能,而且還賦予其抗菌、抗氧化、止血愈創(chuàng)等多重功效[3-4]。筆者以凝血酶為復(fù)凝止血因子,以O(shè)-CMC為止血基材和凝血酶固定化載體,以戊二醛為交聯(lián)劑,采用冷凍干燥技術(shù)優(yōu)化并制得了具有凝血酶固定化作用的O-CMC復(fù)凝止血海綿。筆者在本實(shí)驗(yàn)中擬對這一新型止血劑的體外表征進(jìn)行詳細(xì)研究,并初步考察其止血效果,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與儀器

1.1 動物 日本大耳白兔5只,雄性2只,雌性3只,飼養(yǎng)環(huán)境及設(shè)施環(huán)境:普通級,體質(zhì)量(2.6±0.2)kg,武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供,合格證號: 4210000241,使用證號:00070998,許可證號:SYXK (鄂)2008-0007。

1.2 試藥 O-CMC(自制,批號:20121124)、凝血酶(黑龍江迪龍制藥有限公司,規(guī)格:每瓶500 U,批號: 20100601),25%戊二醛水溶液(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠,批號:2010031S),甘露醇(青島明月海藻集團(tuán)有限公司,批號:20100221),10%水合氯醛(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科制劑室,批號:20110923),吸收性明膠海綿(金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠,批號:110208),其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 EMS-8A電熱式磁力攪拌器(天津市歐諾儀器儀表有限公司),LGJ-冷凍干燥機(jī)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠),電子天平(Mettler-Toledo Group), Quanta 2000型環(huán)境掃描電鏡(FEI公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 O-CMC復(fù)凝止血海綿的制備 稱取O-CMC適量,溶于0.9%氯化鈉溶液,配制濃度為2.49 mg·mL-1O-CMC溶液。將25%戊二醛用純化水稀釋,制得濃度為0.49 mg·mL-1的戊二醛溶液。將凝血酶溶于0.9%氯化鈉溶液,制得濃度為49.87 U·mL-1凝血酶溶液。取O-CMC溶液10 g,置25 mL燒杯,緩慢滴加凝血酶溶液5 mL;攪拌10 min,另取戊二醛溶液0.1 mL和5%甘露醇1 mL,加入上述溶液中,攪拌均勻。將該混合液倒入直徑6 cm培養(yǎng)皿,待完全膠凝后,置-20℃預(yù)凍24 h,再于-20℃真空冷凍干燥48 h,取出,即得O-CMC復(fù)凝止血海綿。

2.2 O-CMC復(fù)凝止血海綿的體外表征

2.2.1 O-CMC復(fù)凝止血海綿的外觀形態(tài) 肉眼觀察,自制止血海綿呈類白色,具有良好的韌性,疏松多孔,浸泡后膨脹且柔軟;電鏡下觀察網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰,孔徑均勻,疏密合適,見圖1。

A.直觀圖;B.電鏡圖(×80)圖1 O-CMC復(fù)凝止血海綿的外觀形態(tài)A.direct-viewing figure;B.electron microscope figure(×80)Fig.1 Appearance and morphology of O-CMC multihemostatic sponge

2.2.2 O-CMC復(fù)凝止血海綿的孔隙率 選用10 mL量瓶,用乙醇定容,精密稱質(zhì)量,記為Wa;取自制止血海綿,精密稱質(zhì)量,記為W0,置于乙醇中脫氣,使乙醇充盈于多孔海綿的孔隙中,然后加乙醇至刻度,精密稱質(zhì)量,記為Wb。將浸滿乙醇溶液的止血海綿取出,準(zhǔn)確稱量剩余的乙醇與量瓶的總質(zhì)量(Wc),按下式計(jì)算孔隙率:孔隙率(%)=(Wb-Wc-W0)/(Wa-Wc)× 100%,結(jié)果見表1。O-CMC復(fù)凝止血海綿的平均孔隙率為67.23%,這一較高孔隙率的止血海綿不僅可以提供足夠的空隙和網(wǎng)狀空間吸收更多的血液,而且能使海綿表面與創(chuàng)口有更大的接觸表面,有利于止血基材O-CMC和復(fù)凝因子凝血酶起到更為迅捷的止血作用。

表1 O-CMC復(fù)凝止血海綿的孔隙率Tab.1 Porosity ratio of O-CMC multi-hemostatic sponge

2.2.3 O-CMC復(fù)凝止血海綿的吸水率 將冷凍干燥制得的O-CMC復(fù)凝止血海綿剪成圓形、長方形和不規(guī)則形等3種形狀。分別精密稱定質(zhì)量,記為W1;然后將不同形狀的止血海綿浸入純化水中,浸泡24 h后,取出并精密稱定質(zhì)量,記為W2。自制止血海綿吸水率按如下公式計(jì)算:吸水率(%)=(W2-W1)/W1×100%,結(jié)果見表2。經(jīng)測量計(jì)算,制得的O-CMC復(fù)凝止血海綿的平均吸水率為38.77%,不同形狀止血海綿的吸水率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2.4 O-CMC復(fù)凝止血海綿的密度 將干燥的OCMC復(fù)凝止血海綿裁剪成規(guī)則的矩形,精密稱定質(zhì)量,記為W;分別測量矩形的長、寬、高,計(jì)算其體積( V),即可根據(jù)公式求出止血海綿的密度(ρ),ρ=W/V,計(jì)算結(jié)果見表3,自制O-CMC復(fù)凝止血海綿的平均密度為0.043 4 g·(cm3)-1。

2.3 O-CMC復(fù)凝止血海綿的止血作用

2.3.1 止血效果驗(yàn)證 采用10%水合氯醛麻醉日本大耳兔(腹腔注射,1～1.5 mL·kg-1,受試?yán)龜?shù):5),麻醉后耳部脫毛。用外科手術(shù)刀在耳部外側(cè)中央處做一個(gè)創(chuàng)面2 cm×1 cm,其中耳動、靜脈橫向切斷,但不使耳朵切透,以防止血液從兔耳部內(nèi)側(cè)流出而影響觀察效果。待傷口流出的血液充滿創(chuàng)面后,立即在兔耳出血處覆蓋止血材料,外平鋪加蓋紗布,并用50 g砝碼壓迫,每30 s觀察1次,直至出血停止。記錄傷口出血到止血完成的時(shí)間,即為止血時(shí)間;止血后,將止血材料與紗布一起置入稱量瓶密封,精密稱重,計(jì)算該值與止血前各種止血材料和所用紗布的總質(zhì)量的差值,即得出血量:出血量(g)=止血后材料質(zhì)量-止血前材料質(zhì)量。

表2 不同形狀O-CMC復(fù)凝止血海綿的吸水率Tab.2 Water absorption ratio of O-CMC multihemostatic sponge with different shapes

表3 O-CMC復(fù)凝止血海綿的密度Tab.3 Density of O-CMC multi-hemostatic sponge

采用上述兔耳動、靜脈創(chuàng)傷出血模型進(jìn)行止血實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,O-CMC復(fù)凝止血海綿的止血時(shí)間和出血量分別為(26.96±3.80)s和(0.045±0.020)g;市售吸收性明膠海綿(陽性對照)的止血時(shí)間和出血量分別為(100.4±11.2)s和(0.15±0.03)g;醫(yī)用紗布(陰性對照)的止血時(shí)間和出血量分別為(218.2± 10.6)s和(2.57±0.54)g。O-CMC復(fù)凝止血海綿對創(chuàng)傷出血模型的止血時(shí)間和出血量顯著低于陽性對照組(n=4,P＜0.01)和陰性對照組(P＜0.01),說明自制O-CMC復(fù)凝止血海綿的止血效果良好。

2.3.2 止血可靠性觀察 待兔耳動、靜脈創(chuàng)傷出血模型使用止血材料完全止血后,除去砝碼,于30 min內(nèi)繼續(xù)觀察其是否有續(xù)發(fā)性再出血現(xiàn)象(受試?yán)龜?shù):5),結(jié)果O-CMC復(fù)凝止血海綿、市售吸收性明膠海綿和醫(yī)用紗布的30 min內(nèi)再出血例數(shù)分別為0,2,5例。

由結(jié)果可知,兔耳動、靜脈創(chuàng)傷出血模型使用醫(yī)用紗布止血后,均出現(xiàn)再出血現(xiàn)象,說明醫(yī)用紗布只是壓迫止血,不能使創(chuàng)面主動形成凝血塊,當(dāng)移走砝碼后,傷口再度破裂,導(dǎo)致出血;市售吸收性明膠海綿對于出血量較多的兔耳動脈血管的止血效果不理想,盡管可以形成凝血塊,但是由于動脈內(nèi)血壓較高,容易沖破已經(jīng)形成的凝血塊而發(fā)生再次出血現(xiàn)象。自制O-CMC復(fù)凝止血海綿對兔耳動、靜脈血管均具有較好的止血作用,無續(xù)發(fā)性再出血現(xiàn)象,止血效果可靠。據(jù)此得出如下結(jié)論:對于靜脈和較小的動脈出血,O-CMC復(fù)凝止血海綿和市售吸收性明膠海綿均有較好的止血效果,依次排序?yàn)?自制O-CMC復(fù)凝止血海綿≈市售吸收性明膠海綿＞醫(yī)用紗布;而對于較大的動脈出血,自制O-CMC復(fù)凝止血海綿比市售吸收性明膠海綿的止血效果更佳。

3 討論

采用冷凍干燥技術(shù)制得的O-CMC復(fù)凝止血海綿呈類白色,具有良好的韌性,疏松多孔,質(zhì)地柔軟,浸泡后均勻膨脹;孔隙率為67.23%,吸水率為38.77%,密度為0.043 4 g·(cm3)-1,理化性質(zhì)穩(wěn)定,符合海綿劑的要求。

以自制O-CMC復(fù)凝止血海綿與市售吸收性明膠海綿進(jìn)行止血效果的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),自制止血海綿與市售吸收性明膠海綿相比,其止血時(shí)間更短,出血量更少,且無續(xù)發(fā)性再出血現(xiàn)象。

自制O-CMC復(fù)凝止血海綿理化性質(zhì)穩(wěn)定,止血效果理想,使用、攜帶方便,作為一種新型創(chuàng)傷止血制劑值得進(jìn)一步深入研究。

[1] 郭仕華,賀艷麗.殼聚糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].食品與藥品,2005,7(8):1-4.

[2] 郭苗苗,徐丹,劉輝,等.水溶性O(shè)-羧甲基殼聚糖的制備及結(jié)構(gòu)表征[J].中國藥師,2012,15(3):296-300.

[3] 董鵬飛.羧甲基殼聚糖在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)展[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,32(6):445-447.

[4] 吳迪,劉輝,浦金輝,等.O-羧甲基殼聚糖抑菌作用研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2013,32(2):142-145.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.003

In vitro Characteristics and Hemostatic Effect of O-carboxymethyl Chitosan Multi-hemostatic Sponge

LIU Hui1,ZOU Qing-he2,WU Di1,3
(1.Department of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China;2.Department of Pharmacy,the First Hospital of Yidu City,Yidu 443300,China;3.Postgraduate 2010,College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

ObjectiveTo investigate the characteristicsin vitroand hemostatic function of O-carboxymethyl chitosan multi-hemostatic sponge.MethodsFreeze-drying technology was applied on preparation of O-carboxymethyl chitosan hemostatic sponge.The physicochemical properties of the self-produced multi-hemostatic sponge were observed for its appearance, porosity rate,water absorption,and density.The hemostatic effect was compared between the self-produced hemostatic sponge and commercially available absorbable gelatin sponge in rabbit models with ear venous and arterial injuries.ResultsThe selfproduced hemostatic sponge was off-white and full of pores with good tenacity and even net texture.Its porosity ratio,water absorption rate,and density were 67.23%,38.77%,and 0.043 4 g·(cm3)-1,respectively.The bleeding time volume were significantly lower fromthe self-produced sponge than that fromthe commercially available gelatin sponge.No secondary rebleeding was observed.ConclusionThe self-produced O-carboxymethyl chitosan multi-hemostatic sponge displays stable physicochemical characteristics and reliable hemostatic effect.

O-carboxymethyl chitosan;Multi-hemostatic sponge;Characteristicsin vitro;Hemostasis function

R286;R965

A

1004-0781(2014)07-0850-03

2013-07-17

2013-08-20

*武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃(200960323135);全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”計(jì)劃課題(CWS11C27)

劉輝(1971-),男,湖北仙桃人,副主任藥師,博士,研究方向:藥物新劑型與新技術(shù)。電話:027-68879030,E-mail:pharmacyman@126.com。