張 晨，趙法茂，胡春龍，劉正帥，劉貴芬，賈 曉

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點實驗室，山東泰安 271000;2.泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東泰安 271021)

大杯蕈(Clitocybe maxima)在真菌分類學(xué)上，屬擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、口蘑科(Tricholomataceae).大杯蕈營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量豐富，必需氨基酸的數(shù)量及組成比一般食用菌更接近模式蛋白.另還含有多種人體必需的礦物元素，如鋅、鉬、鈷等微量元素.經(jīng)全國各地引種栽培，大杯蕈已實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，市場前景廣闊.近幾年來，食用菌多糖在人體醫(yī)療保健中的作用日益引起人們的關(guān)注.食藥用多糖的組成和結(jié)構(gòu)主要有以下幾種類型:(1)葡聚糖，是食用菌多糖中的主要構(gòu)成部分，其主鏈?zhǔn)怯搔?1，3糖苷鍵連接，支鏈由β-1，6糖苷鍵連接，如香菇多糖;(2)甘露聚糖，其主鏈?zhǔn)怯搔?1，4糖苷鍵連接，如靈芝多糖;(3)雜多糖;(4)糖蛋白和多糖肽等［1-2］.

食用菌多糖是能夠控制細胞分裂分化，調(diào)節(jié)細胞生長衰老的一類活性多糖，主要由幾丁質(zhì)和β-(1，3)-D-葡聚糖構(gòu)成，它主要是從擔(dān)子菌與子囊菌子實體、菌絲體和發(fā)酵液中分離出的具有生物活性的天然高分子多聚物.藥理實驗表明，食用菌多糖具有調(diào)節(jié)人體機能、提高免疫力、增強骨髓造血功能及抗輻射、抗癌、抗病毒、抗腫瘤、延緩衰老、降血脂、促進兒童生長發(fā)育等生理功能［3］;還可通過非特異性途徑，提高機體對抗原或微生物病原體的特異性反應(yīng)［4］，因而被稱為“生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑”.目前國內(nèi)外對大杯蕈研究主要集中在探討其生物學(xué)特性、化學(xué)組成成分、營養(yǎng)價值及高產(chǎn)栽培技術(shù)等，但對其含有的生物活性成分尤其是多糖的研究比較缺乏［5-6］.本實驗擬利用Plackett-Burmn實驗(PB實驗)和響應(yīng)面分析法(Response surface methodology，RSM)優(yōu)化大杯蕈子實體多糖(Fruting body polysaccharide，F(xiàn)PS)的分離提取條件，并對其體外抗氧化活性作初步分析，旨在為大杯蕈子實體多糖提取工藝的優(yōu)化及構(gòu)效關(guān)系的深入研究提供理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 實驗材料

大杯蕈(Clitocybe maxima)子實體，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供.

1.2 實驗方法

1.2.1 大杯蕈子實體多糖PB實驗

(1)大杯蕈子實體多糖的提取

大杯蕈烘干后于粉碎機中粉碎成粉末，-4℃冰箱保存?zhèn)溆?使用DX8Trial軟件繪制大杯蕈子實體多糖PB實驗表格(表1)，采用9因素3水平的方案，各因素對應(yīng)項目如表1.分別稱取0.5 g大杯蕈子實體粉末放入編號為1～17的離心管中.按照表1所示實驗項目進行實驗，得到17組大杯蕈多糖提取物.向17只離心管中加入20 ml水，70℃左右水浴，直至溶解.3600×g離心15 min.取1ml上清液置于試管中，稀釋10倍，分別取1 ml稀釋液設(shè)置三組平行試驗.分別向每支平行試管中加入1 ml去離子水，1 ml新配苯酚溶液，5ml濃硫酸.反應(yīng)20 min，于490nm下測定OD值.

表1 大杯蕈子實體多糖的PB試驗因素水平及編碼

(2)大杯蕈多糖含量測定:苯酚—硫酸法［7］

苯酚-硫酸法是利用高濃度的硫酸可以在短時間內(nèi)將多糖水解成寡糖和單糖，或者多糖經(jīng)脫水生成糠醛或其衍生物，苯酚類試劑可與游離的單糖、寡糖、糖醛酸或甲苯衍生物起顯色反應(yīng)，已糖在490 nm處，戊糖及糖醛酸在480 nm處有最大光吸收，且吸光值與糖含量成正比.

6%苯酚溶液配制:

熱水浴條件下，量取6 mL苯酚溶于10 mL容量瓶中，用去離子水定容，搖勻后，即得到約為6%的苯酚溶液.置于棕色瓶中備用(現(xiàn)配現(xiàn)用).

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:

準(zhǔn)確稱取105℃下干燥的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0.1 g，加去離子水定容至100 mL，取10 mL，再定容到100 mL，即得100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液.精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別加去離子水至2 mL，以2 mL去離子水作為空白對照，分別加入1 mL苯酚，5 mL濃硫酸，靜置10 min，充分搖勻后室溫放置20 min，于490 nm下測OD值，以O(shè)D值對葡萄糖含量回歸，得回歸曲線(圖1).

式中:C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測定管中葡萄糖質(zhì)量(mg);

V1—樣品提取時定容體積(mL);

V2—樣品比色管中取樣液體積(mL);

m—樣品稱量質(zhì)量(mg).

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.2 大杯蕈子實體多糖響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)上述PB實驗的結(jié)果，使用Design-Expert對數(shù)據(jù)進行回歸分析.選擇對多糖提取量影響顯著的pH，提取溫度，提取次數(shù)繼續(xù)進行下一步實驗(表2).分別稱取0.5 g大杯蕈子實體粉末放入編號為1～17的離心管中.按照表2所示實驗項目進行實驗，得到17組大杯蕈多糖提取物.向17只離心管中加入20 mL水，70℃左右水浴，直至溶解，3600×g離心15 min.取1 mL上清液置于試管中，稀釋10倍，再取1 ml稀釋液設(shè)置三組平行試驗，分別向每支平行試管中加入1 mL去離子水，1 mL新配苯酚溶液，5 mL濃硫酸，反應(yīng)20 min后于490nm下測定OD值.

表2 大杯蕈子實體多糖的響應(yīng)面試驗因素水平及編碼

1.2.3 大杯蕈多糖體外抗氧化能力測定

(1)還原力測定——普魯士藍法［8］

取1 mL樣品，加入2.5 mL 0.2 mol/L的pH 6.6的磷酸緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀，混合后50℃恒溫水浴20 min.用流水冷卻后，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸充分混合，3000×g離心15 min.取2.5 mL上清液加入2.5 mL去離子水和2.5 mL 0.1%的三氯化鐵，靜置10 min.用去離子水作為對照，于700 nm波長下測定OD值.

(2)清除羥基自由基—鄰二氮菲-Fe2+氧化法［9］

取1 mL樣品，加入4 mL 0.2 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖液，1 mL 7.5 mmol/L硫酸亞鐵和1.5 mL 5 mmol/L鄰二氮菲，立即混勻，再加入1 mL H2O2后37℃保溫1 h.以去離子水代替H2O2作為空白對照，于536 nm下測定OD值.

其中:EC50代表產(chǎn)生50%清除率所需的樣品濃度(mg/L).

A:樣品+H2O2;

Ai:無樣品無H2O2;

Aj:無樣品有H2O2.

(3)清除超氧陰離子自由基［10］

取1 mL樣品加入4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl和3.2 mL去離子水，25℃下保溫20 min，再加入0.3 mL鄰苯三酚(經(jīng)過25℃水浴保溫20 min)，反應(yīng)3min后，加入1 mL 5%VC終止反應(yīng)，于420 nm下的測定OD值.

其中:A0:去離子水;

A:樣品.

(4)清除2，2—二苯代苦味肼(DPPH)自由基［11］

取2mL樣品加入2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液，混合均勻，30 min后在波長517 nm下測定OD值A(chǔ)i.同法測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液與2 mL去離子水混合后的OD值A(chǔ)c，以及2 mL樣品與2 mL去離子水混合后的OD值A(chǔ)j.

2 結(jié)果與分析

2.1 大杯蕈子實體多糖的提取優(yōu)化

2.1.1 PB 實驗

通過軟件Design Expert對實驗結(jié)果進行分析，大杯蕈子實體多糖的PB試驗結(jié)果見表3，PB試驗的ANOVA分析(方差分析)見表4.結(jié)果表明，該模型的回歸性良好.通過P值分析，影響大杯蕈子實體多糖提取量的顯著因素是醇沉?xí)r間，乙醇倍數(shù)和提取次數(shù)，其余為不顯著或者是可忽略因素.

表3 大杯蕈子實體多糖的PB實驗結(jié)果

表4 大杯蕈子實體多糖PB實驗得率ANOVA分析

2.1.2 響應(yīng)面法

在響應(yīng)面實驗中，利用軟件Design Expert對pH，提取溫度和提取次數(shù)三個因素進行優(yōu)化，響應(yīng)面實驗設(shè)計見表5.ANOVA分析顯示模型顯著，失擬值不顯著，說明模型和現(xiàn)實的擬合程度較好(表6).

對于大杯蕈子實體多糖的PB試驗所得的三個主要影響因素乙醇倍數(shù)、醇沉?xí)r間和提取次數(shù)，通過計算機輔助軟件Design Expert進行設(shè)計，通過模型分析得到回歸方程:

方差分析顯示，該模型的P-value值小于0.05，為顯著水平;Lack of Fit不顯著，說明該模型能很好地說明多糖的實際產(chǎn)量.

通過實驗分析可得，大杯蕈子實體多糖提取的最佳條件是乙醇倍數(shù)3.55，醇沉?xí)r間28.77 h，提取次數(shù)2.57次，在此條件下，大杯蕈子實體多糖的理論得率是2.549%.

表5 大杯蕈子實體多糖響應(yīng)面實驗設(shè)計

表6 大杯蕈子實體多糖RSM實驗得率ANOVA分析

大杯蕈子實體多糖的得率與各因素的關(guān)系如下圖(圖2、圖3、圖4)所示:

圖2 大杯蕈子實體多糖得率與醇沉?xí)r間和乙醇倍數(shù)的關(guān)系

圖3 大杯蕈子實體多糖得率與提取次數(shù)和乙醇倍數(shù)的關(guān)系

圖4 大杯蕈子實體多糖得率與提取次數(shù)和醇沉?xí)r間的關(guān)系

2.2 大杯蕈子實體多糖體外抗氧化活性分析

2.2.1 大杯蕈子實體多糖還原力測定

還原力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)，抗氧化物質(zhì)通過提供電子可使自由基變?yōu)榉€(wěn)定的分子，從而失去活性.研究證實抗氧化活性同還原力是密切相關(guān)的，大杯蕈子實體多糖于700 nm下比色，以吸光值表示還原力的大小，吸光值越大，表明樣品抗氧化能力越好，還原力越強.

大杯蕈子實體多糖的還原能力見圖5.由圖5可知，其還原能力隨著濃度的增加呈上升趨勢.在濃度1000～1500 μg/mL之間，OD值增長幅度很小;當(dāng)濃度達到1500 μg/mL后，OD值呈直線增長;在5000 μg/mL時，大杯蕈子實體多糖的OD值為0.629.

圖5 大杯蕈子實體多糖的還原力測試

2.2.2 對羥基自由基的清除能力

從圖6中可以看出，隨著大杯蕈子實體多糖的濃度的增加，對羥基自由基的清除能力呈上升趨勢，在濃度為2000～2500 μg/mL區(qū)間時清除率增長較快;當(dāng)濃度達到3500 μg/mL后，清除率增長較為平穩(wěn);當(dāng)濃度為5000 μg/mL時，樣品對于羥基自由基的清除率為27.19%.根據(jù)圖線走勢分析，其EC50約等于9500μg/mL.

2.2.3 對超氧陰離子自由基的清除能力

對于超氧陰離子自由基的清除能力如圖7所示，從圖7可以看出，隨著樣品濃度的增加，其對超氧陰離子自由基的清除率呈現(xiàn)上升趨勢.在濃度為1500～2000 ug/mL之間時，大杯蕈子實體多糖對超氧陰離子自由基的清除率增長較為迅速;在濃度為5000 ug/mL時，大杯蕈FPS對于超氧陰離子自由基的清除率為60.101%.通過對圖7分析，大杯蕈子實體多糖的EC50約等于3800 ug/mL.

圖6 大杯蕈子實體多糖對羥基自由基的清除作用

圖7 大杯蕈子實體多糖對超氧陰離子的清除作用

2.2.4 對DPPH的清除作用

DPPH是二苯代苦味肼自由基，有清除劑存在時，其在最大光吸收波長處的吸光值下降，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，以此可以鑒定試驗樣品的抗氧化能力.從圖8可以看出，當(dāng)濃度在1000～1500 ug/mL之間時，對DPPH清除率增長緩慢;當(dāng)濃度達到1500 ug/mL以上時，清除率呈線性增長;在濃度為5000 ug/mL時，大杯蕈對于DPPH的清除率為69.7%.EC50約等于2600 ug/mL.總之，隨著樣品濃度的增加，大杯蕈子實體多糖對DPPH的清除率逐漸增大.

3 討論

影響大杯蕈多糖提取量多少的因素有很多，包括加水倍數(shù)、水浴pH、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間、乙醇體積、乙醇濃度、醇沉?xí)r間、醇沉溫度等.不同蕈菌影響其子實體多糖提取的顯著因素有所不同，影響大杯蕈子實體多糖提取量的顯著因素是醇沉?xí)r間，乙醇倍數(shù)和提取次數(shù);有研究發(fā)現(xiàn)影響香菇子實體多糖提取的顯著因素是pH值、提取次數(shù)、提取溫度［12］.本實驗采用PB實驗和響應(yīng)面法進行優(yōu)化，得到了大杯蕈多糖的最佳提取條件，為大杯蕈多糖的后續(xù)相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

自由基學(xué)說是Denham Harman在1956年提出的，認為機體在生命代謝過程中產(chǎn)生的一些自由基對生命有機體有害，生物體的衰老過程就是自由基不斷積累的結(jié)果.自由基可以誘發(fā)腫瘤形成，這是自由基導(dǎo)致DNA損傷而造成基因突變引起的.此外，自由基可以氧化細胞中的多種物質(zhì)，使生物膜受到損傷;還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，影響其正常功能［13］.因此，自由基生物學(xué)研究越來越受到人們的重視.雖然，生物體內(nèi)存在酶和非酶自由基清除系統(tǒng)，但開發(fā)和尋找外源性自由基清除劑對預(yù)防衰老和治療疾病具有顯著醫(yī)學(xué)意義.本研究證明，大杯蕈子實體多糖具有潛在的體外抗氧化活性，這一研究結(jié)果對深入認識和開發(fā)真菌多糖類藥物具有一定的參考價值.

圖8 大杯蕈子實體多糖對DPPH的清除作用

4 結(jié)論

通過大杯蕈子實體多糖的PB實驗和響應(yīng)面實驗，優(yōu)化了其分離提取條件.通過回歸曲線得到多糖的最佳提取條件是乙醇倍數(shù)3.55，醇沉?xí)r間28.77 h，提取次數(shù)2.57次，在此條件下，大杯蕈子實體多糖的理論得率是2.549%.考慮到操作的方便性，將最佳提取條件調(diào)整為乙醇倍數(shù)3.6，醇沉?xí)r間29 h，提取次數(shù)3.00，在此條件下，大杯蕈子實體多糖的理論得率是2.329%，實際值為2.015%.

本實驗測定了大杯蕈子實體多糖的還原能力以及其對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH的清除能力.當(dāng)濃度為5000 μg/mL時，大杯蕈子實體多糖的還原力為0.629;樣品對于羥基自由基的清除率為27.19%，其EC50約等于9500 μg/mL;對于超氧陰離子自由基的清除率為60.101%，EC50約等于3800 ug/mL;對于DPPH的清除率為69.7%，EC50約等于2600 ug/mL.隨著樣品濃度的增加，大杯蕈子實體多糖還原力逐漸增強，對羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH的清除率也逐漸增大.

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