張 明， 陳 菲， 孫文逵， 吳 婷， 顏文杰， 蘇 欣， 施 毅

EUCAST和CLSI微量稀釋法檢測曲霉體外藥物敏感試驗差異比較

張 明， 陳 菲， 孫文逵， 吳 婷， 顏文杰， 蘇 欣， 施 毅

目的 比較歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）和美國臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）微量稀釋法檢測曲霉體外藥物敏感性的差異。方法 分別用EUCAST方法和CLSI方法檢測116株曲霉對兩性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和米卡芬凈的敏感性，比較兩種方法的基本符合率、藥敏符合率、極重大誤差率和重大誤差率。結(jié)果 EUCAST方法和CLSI方法對116株曲霉藥敏檢測的基本符合率為96．3%～100%。兩方法檢測煙曲霉對伏立康唑的藥敏符合率98．8%，重大誤差為1．2%，極重大誤差率為0。煙曲霉和黑曲霉對兩性霉素B以及煙曲霉和黃曲霉對伊曲康唑的藥敏符合率均為100%，重大誤差率和極重大誤差率均為0。結(jié)論 EUCAST方法和CLSI方法對檢測曲霉體外藥物敏感性具有良好的一致性。

曲霉； EUCAST； CLSI； 最低抑菌濃度； 最低有效濃度

近年來，隨著免疫抑制治療、化療、骨髓移植及實體器官移植等增加，侵襲性曲霉病的發(fā)病率也隨之上升。目前，治療侵襲性曲霉病的主要抗真菌藥物有三唑類和棘白菌素類。然而，自1999年以來，不斷有曲霉對抗真菌藥物耐藥的報道，甚至有報道稱曲霉對伊曲康唑的耐藥率高達8．14%［1］。

目前，曲霉體外藥敏試驗方法主要有稀釋法、紙片擴散法和E試驗法，其中稀釋法準確度高、重復(fù)性好。歐洲抗菌藥物敏感試驗委員會（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）和美國臨床實驗室標(biāo)準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）均發(fā)布了最新微量稀釋法檢測霉菌體外藥敏試驗方法。然而，兩種方法存在一定的差異。EUCAST方法（E．DEF 9．1）要求曲霉孢子濃度為（2～5）×105CFU／m L，用血細胞計數(shù)器計數(shù)，培養(yǎng)基為添加2%葡萄糖的RPMI 1640，微孔板要求平底［2］；CLSI方法（M38-A2）則要求曲霉孢子濃度為（0．4～5）×104CFU／m L，用分光光度計計數(shù)，培養(yǎng)基為RPMI 1640，微孔板要求U型底［3］。兩方法對曲霉體外藥敏試驗的結(jié)果有無差異，國內(nèi)鮮有報道；國外僅有對兩性霉素B或唑類抗真菌藥物兩方法學(xué)的比較［4-6］，而無對棘白菌素類抗真菌藥物的比較。本研究分別采用EUCAST和CLSI微量稀釋法檢測曲霉株對兩性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和米卡芬凈的體外敏感性，比較兩種檢測方法的結(jié)果是否存在差異。

材料與方法

一、材料

（一）試驗菌株 116株受試曲霉（煙曲霉81株、黃曲霉28株、黑曲霉7株）均為臨床分離株，分離自痰液和支氣管肺泡灌洗液。所有曲霉株均經(jīng)菌落形態(tài)、鏡下特征及分子生物學(xué)鑒定，10%甘油-80℃冰凍保存。近平滑念珠菌ATCC 22019為藥敏試驗質(zhì)控菌株。

（二）抗真菌藥物 伏立康唑由輝瑞公司提供，伊曲康唑由楊森制藥有限公司提供，兩性霉素由華北制藥股份有限公司提供，卡泊芬凈由默沙東公司提供，米卡芬凈由安斯泰來制藥有限公司提供。兩性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑用DMSO溶解，卡泊芬凈和米卡芬凈用蒸餾水溶解，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）器材 比濁儀（法國生物梅里埃公司產(chǎn)品），96孔細胞培養(yǎng)板（美國Costar公司產(chǎn)品）。

（四）主要試劑 RPMI 1640粉（美國Sigma-Aldrich公司）；無水葡萄糖（美國AMRESCO公司進口分裝），MOPS（北京索萊寶科技有限公司），DMSO（美國AMRESCO公司進口分裝），含0．1%吐溫20的生理鹽水（自制）。

二、方法

（一）曲霉懸液制備 10%甘油-80℃冰凍保存的曲霉株，快速融解后，用接種環(huán)挑取少量，以三點式接種于沙保弱培養(yǎng)基（SDA），并用封口膜封住。置于35℃培養(yǎng)3～4 d。吸取5 m L含有0．1%吐溫20的生理鹽水于生長曲霉菌落的SDA上，用無菌棉棒輕輕擦拭菌落使之形成懸液。用無菌吸管將曲霉懸液轉(zhuǎn)移至試管中，通過8層無菌紗布過濾以去除菌絲及培養(yǎng)基殘渣，旋渦振蕩15 s混均，適當(dāng)稀釋。

EUCAST方法［2］在光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)孢子，調(diào)整孢子濃度為（2～5）×106CFU／m L，再用生理鹽水1∶10稀釋至2倍終濃度接種懸液［（2～5）×105CFU／m L］；CLSI方法［3］則用比濁儀（法國生物梅里埃公司產(chǎn)品）調(diào)整菌懸液濃度至0．5麥氏濁度單位，懸液濃度為（1～5）×106CFU／m L，再用RPMI1640培養(yǎng)基作1∶100稀釋，得到2倍終濃度接種懸液［（1～5）×104CFU／m L］。

（二）抗真菌藥物濃度配制 根據(jù)EUCAST文獻［2］，配制含2%葡萄糖RPMI1640培養(yǎng)基，并將抗真菌藥物稀釋至2倍于最終試驗濃度（兩性霉素B、卡泊芬凈和米卡芬凈：0．031 2～16 mg／L，伏立康唑和伊曲康唑：0．015 6～8 mg／L）；CLSI方法則直接用RPMI1640將抗真菌藥物稀釋至上述藥物濃度。

（三）曲霉藥敏試驗 各稀釋濃度的藥物100μL依次加入96孔板1～10孔中（EUCAST用平底板，CLSI用U型底板），然后每孔加入100μL曲霉懸液。11孔為單純曲霉生長對照（100μL無藥物培養(yǎng)基+100μL孢子懸液），12孔為空白對照（100μL無藥物培養(yǎng)基+100μL無孢子鹽水）。所有試驗重復(fù)2次。

（四）終點判讀 35℃孵育48 h后判讀結(jié)果。對于兩性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑，觀察其最低抑菌濃度（MIC），即肉眼直接觀察到的無曲霉生長的最小藥物濃度；而卡泊芬凈和米卡芬凈則讀取其最低有效濃度（minimum effective concentration，MEC），即與單純曲霉生長對照孔的菌絲相比，顯微鏡下開始觀察到菌絲變短、變粗和高度分叉改變的最低藥物濃度。判讀結(jié)果超出MIC／MEC試驗范圍的按最高試驗濃度2倍記錄，而低于MIC／MEC試驗范圍的則按最低試驗濃度記錄［5，7］。

（五）兩種方法的一致性分析 比較兩種方法的基本符合率（essential agreement，EA）、藥敏符合率（categorical agreement，CA）、極重大誤差率（very major errors，VME）和重大誤差率（major errors，ME）［5，7］。以及比較兩種方法檢測MIC或MEC的幾何平均數(shù)。EA指EUCAST和CLSI兩方法試驗結(jié)果相差不超過2個濃度梯度的曲霉株數(shù)占受試曲霉株數(shù)的百分比；CA指EUCAST和CLSI兩方法試驗藥敏程度（耐藥／中介／敏感）相同的曲霉株數(shù)占受試曲霉株數(shù)的百分比；VME指EUCAST和CLSI兩方法試驗結(jié)果有一方為耐藥或敏感，而另一方為敏感或耐藥；ME指EUCAST和CLSI兩方法試驗結(jié)果有一方為中介，而另一方為敏感或耐藥。如果比較兩種方法結(jié)果EA≥90%、CA≥95%、VME≤1．5%以及ME≤3%，認為兩方法檢測結(jié)果具有一致性［8-9］。

結(jié) 果

用EUCAST和CLSI兩方法分別對116株曲霉檢測，觀察發(fā)現(xiàn)所有曲霉株在U型底和平底96孔板中均生長良好。在煙曲霉敏感性試驗中，采用EUCAST方法，兩性霉素B的MIC均≤1 mg／L，且檢測出1株煙曲霉，伏立康唑?qū)ζ銶IC＝2 mg／L，而CLSI方法檢測到1株煙曲霉，兩性霉素B對其MIC＝2 mg／L，伏立康唑?qū)ζ銶IC均≤1 mg／L；兩方法均檢測到3株煙曲霉，伊曲康唑?qū)ζ涞腗IC≥4 mg／L；兩方法結(jié)果顯示，卡泊芬凈和米卡芬凈的MEC均≤1 mg／L。在黃曲霉和黑曲霉的敏感性試驗中，兩性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑?qū)λ星怪甑腗IC≤1 mg／L，卡泊芬凈和米卡芬凈的MEC≤1 mg／L。兩性霉素B對曲霉的MIC和卡泊芬凈的MEC的幾何平均數(shù)，EUCAST方法低于CLSI方法；而伏立康唑和伊曲康唑的MIC以及米卡芬凈的MEC的幾何平均數(shù)，EUCAST方法高于CLSI方法。對兩性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和米卡芬凈的敏感性結(jié)果兩方法學(xué)具有較高的EA，其中相差1個濃度范圍的EA煙曲霉組分別為：97．5%、98．8%、96．3%、97．5%和100%；黃曲霉組分別為：100%、96．4%、100%、100%和96．4%；黑曲霉組分別為：100%、100%、100%、100%和100%。而相差2個濃度范圍的EA各曲霉株對各抗真菌藥物均為100%。見表1。

表1 CLSI和EUCAST方法檢測兩性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和米卡芬凈對曲霉株的體外敏感性Table 1In vitrosusceptibilities ofAspergillusisolates to amphotericin B，voriconazole，itraconazole，caspofungin and micafungin as determined by CLSI and EUCAST broth microdilution methods

GM，geometric mean．EA，essential agreement．±1dil，%of results within plus／minus 1 log2 dilution；±2dil，%of results within plus／minus 2 log2 dilutions．

EUCAST公布的曲霉對抗真菌藥物的折點見表2。由于CLSI尚無折點公布，我們根據(jù)經(jīng)CLSI檢測的大樣本曲霉對抗真菌藥物的流行病學(xué)臨界值（ECVs）進行敏感性評估，見表3。采用EUCAST方法測得伏立康唑?qū)?株煙曲霉的MIC＝2 mg／L，根據(jù)EUCAST折點判定為中介；而其在CLSI方法中MIC＝1 mg／L，根據(jù)ECVs值判定為敏感。另外兩方法均檢測到伊曲康唑?qū)?株煙曲霉的MIC≥2 mg／L，根據(jù)EUCAST的折點及CLSI的ECVs值均判定為耐藥，占受試煙曲霉株3．7%。

兩方法檢測煙曲霉對伏立康唑的敏感性試驗CA為98．8%，ME為1．2%，VME為0；煙曲霉和黑曲霉對兩性霉素B以及煙曲霉和黃曲霉對伊曲康唑的CA均為100%，ME和VME均為0。見表4。

表2 EUCAST發(fā)布的曲霉對抗真菌藥物的折點（mg／L）Table 2 European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing（EUCAST）clinical breakpoint of antifungal agents（mg／L）

表3 CLSI方法檢測獲得的曲霉對抗真菌藥物的臨界值Table 3 Clinical and Laboratory Standards Institute antifungal epidemiologic cutoff values（ECVs）

表4 EUCAST和CLSI兩方法檢測曲霉對兩性霉素B、伏立康唑和伊曲康唑的藥敏符合率Table 4 Categorical agreement between the results of EUCAST and CLSI broth microdilution methods for amphotericin B，voriconazole and itraconazole

討 論

本研究分別采用EUCAST和CLSI方法檢測116株曲霉對抗真菌藥物的體外敏感性，結(jié)果顯示兩方法具有較高的一致性：EA為96．3%～100%、CA 100%、VME 0和ME 0～1．2%。Chryssanthou等［4］分別用EUCAST和CLSI方法檢測40株曲霉的體外藥物敏感性，發(fā)現(xiàn)兩方法對伏立康唑敏感性的EA為98．8%。同樣，Pfaller等［7］用兩方法檢測245株曲霉對伏立康唑和伊曲康唑的體外敏感性，結(jié)果顯示EA分別為99．6%和96．3%。Pfaller等［5］隨后研究發(fā)現(xiàn)，兩方法檢測22株煙曲霉、20株黃曲霉和13株黑曲霉對伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬凈和阿尼芬凈敏感性的EA均為100%。

本研究中，兩方法均檢測到伊曲康唑?qū)?株煙曲霉的MIC≥2 mg／L，根據(jù)EUCAST折點和CLSI的ECVs值均判定為耐藥，占所檢測煙曲霉菌株的3．7%。Pfaller等［13］2005年檢測445株曲霉對伊曲康唑的體外敏感性未發(fā)現(xiàn)耐藥株；而Pfaller等［6］2009年再次檢測伊曲康唑?qū)?37株曲霉的體外敏感性，發(fā)現(xiàn)對43株煙曲霉MIC≥2 mg／L，占檢測曲霉的6．75%。可見，曲霉對伊曲康唑的耐藥率呈現(xiàn)上升趨勢。

盡管EUCAST未發(fā)布卡泊芬凈的折點，但CLSI方法測得的ECVs值為0．5 mg／L［12］。我們所檢測的116株曲霉，卡泊芬凈對其的MEC均≤0．5 mg／L。Pfaller等［6］用CLSI方法檢測526株曲霉對卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈的體外敏感性，發(fā)現(xiàn)這3種棘白菌素類抗真菌藥物對超過99%曲霉株的MEC≤0．06 mg／L。同樣，Lockhart等［14］用CLSI方法檢測288株曲霉藥物敏感性發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈對超過90%的曲霉株的MEC≤0．06 mg／L。我們應(yīng)用CLSI方法和EUCAST對116株曲霉檢測均發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈和米卡芬凈對曲霉株同樣具有較高的抑菌活性，MEC≤0．06 mg／L的曲霉株占試驗菌株的94．8%。

EUCAST方法檢測兩性霉素B對曲霉MIC的幾何平均數(shù)較CLSI方法的低。Espinel-Ingroff等［10］用CLSI方法檢測8個中心的3 988株煙曲霉對兩性霉素B的敏感性發(fā)現(xiàn)，MIC≥2 mg／L和MIC≥4 mg／L曲霉株分別為214株（5．36%）和9株（0．23%），而應(yīng)用EUCAST方法檢測1個中心的833株煙曲霉對兩性霉素B的敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，MIC≥2 mg／L和MIC≥4 mg／L曲霉株分別為7株（0．84%）和1株（0．12%）。我們還發(fā)現(xiàn)，伏立康唑?qū)η筂IC的幾何平均數(shù)EUCAST方法高于CLSI方法，且應(yīng)用EUCAST方法檢測到伏立康唑?qū)?株煙曲霉的MIC＝2 mg／L，而CLSI方法檢測對該曲霉株MIC＝1 mg／L。Chryssanthou等［4］同樣發(fā)現(xiàn)，伏立康唑?qū)η?MIC幾何平均數(shù)EUCAST方法較CLSI方法的高。

總之，盡管EUCAST方法和CLSI方法對曲霉孢子濃度、孢子計數(shù)方式、培養(yǎng)基成分及微孔板類型的要求有所區(qū)別，但本研究顯示兩方法對曲霉體外藥物敏感性試驗具有良好的一致性，對臨床有同樣的參考意義。

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Comparison of susceptibility testing by EUCAST and CLSI broth microdilution methods againstAspergillusisolates

ZHANG Ming，CHEN Fei，SUN Wenkui，WU Ting，YAN Wenjie，SU Xin，SHI Yi．
（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Nanjing University，Clinical School of Medicine，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Nanjing210002，China）

Objective To compare the results of susceptibility testing by European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing（EUCAST）and Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）broth microdilution methods againstAspergillusisolates．Methods The susceptibilities of 116Aspergillusisolates were determined for amphotericin B，voriconazole，itraconazole，caspofungin and micafungin according to EUCAST（E．DEF 9．1）and CLSI（M38-A2）methods．The essential agreement（EA），categorical agreement（CA），very major errors（VME）and major errors（ME）of the two methods were compared．Results The EA was 96．3%-100%between the two methods．The CA，ME，and VME were 98．8%，0-1．2%and 0 respectively for the susceptibility ofAspergillus fumigatusto voriconazole．The CA，ME and VME was 100%，0 and 0 respectively for the susceptibility ofAspergillus fumigatusandAspergillus nigerto amphotericin B，or the susceptibility ofAspergillus fumigatusandAspergillus flavusto itraconazole．Conclusions The results of susceptibility testing by EUCAST and CLSI broth microdilution methods are well consistent againstAspergillusisolates．

Aspergillus；European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing；Clinical and Laboratory Standards Institute；minimum inhibitory concentration；minimum effective concentration

R378

A

1009-7708（2014）04-0338-06

2013-11-07

國家自然科學(xué)基金面上項目（81270064）。

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院）呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南京 210002。

張明（1982—），男，碩士研究生在讀，主要從事呼吸內(nèi)科疾病診治工作。

施毅，E-mail：shiyi56＠126．com。