齊魯,丁彥青,

1. 南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學系,廣州 510515;

2. 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院病理科,廣州 510515

大腸癌早期癥狀不明顯,發(fā)現時通常已發(fā)生轉移,且轉移是影響大腸癌患者預后的重要因素,是否發(fā)生轉移與患者的生存時間密切相關。因此轉移是大腸癌主要危害之一,篩選大腸癌轉移相關信號調控網絡中的關鍵調控點,對闡明大腸癌轉移分子機制、尋找有效的藥物治療靶點有著重要意義。

在本課題組前期研究工作中,利用 GSEA[1](Gene set enrichment analysis)工具對具有 TNM(Tumor node metastasis)分期信息的大腸癌表達譜數據進行了功能富集分析,比較分析了早期T1、T2期和晚期M1期的大腸癌表達譜數據,GSEA富集類別選擇 miRNA作用位點基因集以及轉錄因子結合位點基因集,最終篩選出了與大腸癌轉移密切相關的miRNA及轉錄因子結合位點,對相關富集類中表達上調的基因取交集,獲得在大腸癌晚期 M1期表達上調、且上游調控區(qū)域具有較多轉移相關miRNA作用位點和轉錄因子結合位點的關鍵基因 CREB5(cAMP responsive element binding protein 5)[2]。

本課題組利用SAM3.01[3](Significance Analysis of Microarrays)對具有生存時間信息的大腸癌表達譜數據進行分析,篩選出與大腸癌患者生存時間相關的基因共235個,利用TFM-Explorer[4](The transcription factor matrix explorer)工具對235個基因進行轉錄因子結合位點富集分析,獲得與大腸癌生存時間密切相關的轉錄因子結合位點,對轉錄因子結合位點所對應的基因取交集,獲得含有生存相關轉錄因子結合位點較多的基因,將這些基因與早期轉移大腸癌中表達上調的基因集取交集,得到與患者生存時間相關、受轉錄因子調控較多、且在大腸癌組織中表達上調的關鍵基因同樣為CREB5[5,6]。

CREB5基因受到很多轉移相關轉錄因子和miRNA以及生存相關轉錄因子的調控,且與大腸癌患者生存時間密切相關,因此CREB5基因可能為大腸癌轉移相關信號調控網絡中的關鍵調控點。

CREB5又稱為CRE-BPA,屬于環(huán)磷酸腺苷反應元件結合蛋白家族,定位于 7號染色體短臂,具有鋅指結構和亮氨酸拉鏈結構域,是一種轉錄激活因子。CREB5 主要包含 4 種可變剪切體: α,β,γ,δ[7],并且其在黑猩猩(Pan troglodytes)、狗(Canis lupus familiaris)、牛(Bos taurus)、鼠(Rattus norvegicus)、雞(Gallus gallus)、斑馬魚(Danio rerio)等物種中高度保守。CREB5能夠與c-Jun和 ATF2組合成為異二聚體并與基因轉錄調控區(qū)域的環(huán)磷酸腺苷反應元件相結合,調控基因的表達[8]。CREB5基因的表達受很多因子的調控,此基因表達水平的變化對細胞信號調控網絡有著重要影響,其在不同物種中高度保守以及具有較多的可變剪切體進一步說明了其功能的重要性。因此,本研究通過生物信息學方法分析CREB5在大腸癌轉移作用中可能的調控機制,明確其可能調控的相關基因,進一步闡明大腸癌轉移過程中細胞信號網絡的變化機制。

1 材料和方法

1.1 基于CREB5基因表達值的富集分析

CREB5基因表達受到很多轉錄因子及 miRNA的精密調控,為了分析CREB5基因的表達對大腸癌細胞信號調控網絡的影響,本文對 NCBI[9]網站中GEO(Gene expression omnibus)數據庫[10]的表達譜數據GSE2109進行GSEA分析。由于GSE2109數據包含2158個各類腫瘤組織數據,提取其中屬于大腸癌的表達譜數據共 343例,這些表達譜數據均具有TNM等分期信息且此數據樣本量較大。由于CREB5基因的表達值在不同狀態(tài)的大腸癌患者中表達情況不同,為了闡明CREB5基因表達的高低對大腸癌表達譜的影響情況,將343例表達譜數據依據CREB5基因表達情況分為高低兩組。對數據進行以下處理:首先將表達譜數據依據CREB5基因的表達值從高到低進行排序,然后將數據分成 3段,頭尾兩段分別包含114例大腸癌數據,中間段包含115例大腸癌數據,最后刪除中間段數據。因此頭段為CREB5基因高表達組,尾段為CREB5基因低表達組。使用GSEA分析工具對兩組數據依據 KEGG[11](Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路、生物進程、分子功能及轉錄因子結合位點基因集進行富集分析,基因集版本為V4.0。

1.2 CREB5所調控的腫瘤相關基因分析

由于 CREB5能夠與 c-Jun結合成為異二聚體共同調控基因的表達,而c-Jun蛋白又是AP-1的重要組成部分[12],因此CREB5的調控作用與AP-1密切相關。通過GSEA工具基于轉錄因子結合位點基因集進行富集分析,將富集結果中屬于AP-1富集類的上調基因進行提取,然后與 KEGG通路富集結果中屬于癌癥通路(Pathways in cancer)富集類的上調基因取交集,得到既在CREB5基因高表達組中表達上調,又具有AP-1轉錄因子結合位點,且屬于癌癥通路的關鍵基因,對這些關鍵基因通過 GeneMANIA工具[13]進行共表達分析,驗證這些基因的表達情況是否與CREB5基因表達相關聯,并且分析這些基因所參與的分子功能,明確CREB5基因在大腸癌轉移過程中可能的調控機制。

2 結果與分析

2.1 基于CREB5基因表達值的富集分析結果

對343例大腸癌表達譜數據基于CREB5基因表達值而分成的高、低兩組各114例數據進行GSEA富集分析,在生物進程基因集中,總共有 562個基因集,而CREB5基因高表達組有385個基因集表達上調,且 FDR小于 25%的基因集有 145個,而CREB5基因低表達組只有 177個基因集表達上調,且只有3個基因集的FDR小于25%。因此,CREB5基因高表達對大腸癌生物進程影響較大,且高表達組所參與的生物進程主要包括細胞遷移、血管生成、細胞增殖等與腫瘤發(fā)生和轉移密切相關的分子事件(圖1)。通過對分子功能富集分析,發(fā)現CREB5基因高表達組基因主要參與RHO、RAS、GTP酶、蛋白酪氨酸激酶等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的分子功能(表 1),且 P值及錯誤發(fā)現率(FDR)均很低,說明結果可靠。而通過對兩組數據進行轉錄因子結合位點基因集的富集分析可以發(fā)現,總共 572個基因集中,CREB5基因高表達組有479個基因集表達上調,且有422個基因集的FDR小于25%,而低表達組中只有93個基因集表達上調,且沒有基因集的FDR小于25%,說明CREB5基因的高表達對大腸癌細胞的轉錄調控作用影響較大。在高表達富集類中,依據標準化富集分數排序,前20個轉錄因子結合位點中有7個為轉錄因子AP-1結合位點,說明由于CREB5基因的高表達而影響的許多基因均可能同時受到 AP-1的轉錄調控。由于c-Jun為轉錄因子AP-1的重要組成部分且能夠與 CREB5結合成為異二聚體調控基因的表達,因此進一步說明了CREB5與AP-1在調控基因表達過程中有著密切的聯系。同樣,使用KEGG通路基因集進行富集分析,發(fā)現CREB5基因高表達組所參與的信號通路主要為癌癥通路。為了驗證上述結果的可靠性,使用另一表達譜數據GSE17536進行同樣的分析,得出了相似的結論,因此進一步證實了CREB5基因在大腸癌的發(fā)生發(fā)展轉移中起著重要作用。

圖1 CREB5基因高表達組主要參與的分子事件

為了驗證7個AP-1結合位點富集類中上調基因的調控區(qū)域確實具有AP-1結合位點,以及這些基因所關聯的相關疾病情況,提取7個AP-1富集類中表達上調且不重復的基因共 219個,使用 WebGestalt工具[14]進行轉錄因子結合位點富集以及相關疾病富集分析(表2)。結果發(fā)現,轉錄因子結合位點富集結果主要為AP-1結合位點,而相關疾病富集結果也發(fā)現這些基因主要參與了上皮性腫瘤的發(fā)展和侵襲,說明這些基因與大腸癌的進展關系密切。由于 219個基因轉錄調控區(qū)域具有 AP-1結合位點,且在CREB5基因高表達組中表達上調,因此這些基因可能為CREB5所調控的重要基因。

2.2 CREB5所調控的腫瘤相關基因分析

由于219個基因可能受CREB5調控,且這些基因參與的相關疾病主要為上皮性腫瘤的發(fā)展和侵襲。為了進一步篩選這些基因中與大腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關的基因,將 KEGG通路富集結果中屬于癌癥通路且起著富集作用的上調基因進行提取,得到在CREB5基因的高表達組中表達上調且屬于癌癥通路的基因共104個,然后將這些基因與具有AP-1結合位點的 219個基因取交集,獲得交集基因共 16個,分別為 TGFBR2、TCF7、SUFU、STAT5B、PDGFRB、MMP9、MET、MAPK10、LAMC2、LAMC1、IL6、FIGF、FGF11、CSF1R、CDKN1A、AKT3。為了驗證這些基因是否可能受 CREB5的調控,利用GeneMANIA工具將這16個基因連同CREB5基因進行共表達分析。結果表明,網絡中 77.52%的基因均具有共表達關系,而 16個基因和 CREB5中,除了SUFU,其余基因均直接或者間接具有共表達關系(圖2A),進一步驗證了CREB5可能能夠調控16個

分子功能基因數NOM p-值FDR q-值基因的表達。通過對網絡中基因參與的分子功能分析可以發(fā)現,網絡中得分最高的前幾個分子功能均為調控細胞的運動和遷移,主要涉及 CSF1R、MMP9、PDGFRB、FIGF和IL6所構成的子網絡(圖2B),說明 CREB5可能是通過調控這些基因進而影響大腸癌細胞的遷移。

表1 CREB5基因高表達組參與的分子功能

表2 7個AP-1富集類中上調基因的轉錄因子及相關疾病富集分析

圖2 CREB5及其可能調控的16個基因的共表達分析結果

3 討 論

大腸癌細胞在遷移過程中細胞內的許多信號分子均會發(fā)生一系列變化,這種變化相互影響和級聯傳遞構成了細胞內復雜的信號調控網絡。信號調控網絡中存在著關鍵調控節(jié)點,調控節(jié)點在信號通路的收斂及放大的過程中具有十分重要的作用。明確信號調控網絡中關鍵調控點的作用機制,對理解這些信號分子變化所引起的細胞生物學行為的變化有著重要意義。通過前期研究分析篩選,獲得了可能在大腸癌轉移過程中受到調控作用較多的轉錄因子CREB5,前期的研究發(fā)現在CREB5基因的上游調控區(qū)域富集著許多轉錄因子結合位點,而這些轉錄因子結合位點在大腸癌轉移以及患者生存時間相關基因上游調控區(qū)域中出現頻率較高。并且CREB5基因在進化上高度保守,具有較多的可變剪切體以及與大腸癌患者生存時間密切相關。且其生存曲線顯示CREB5基因在低表達時患者生存率較高,但中表達時的生存曲線與高表達時相貼近,生存率均較低,說明 CREB5基因的表達對患者生存時間影響較大。由于CREB5基因的相關文獻報道很少,為了闡明其在大腸癌轉移過程中可能的作用機制,本研究將大腸癌表達譜數據根據CREB5基因的表達值分為高表達組和低表達組,基于兩組數據基因表達的差異情況進行相關分子事件的富集分析,富集結果顯示CREB5基因高表達組參與的分子事件多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。由于CREB5能夠與c-Jun結合成為異二聚體,且轉錄因子結合位點富集結果顯示AP-1結合位點富集程度最高,而c-Jun為AP-1的重要組成部分,因此具有AP-1結合位點的上調基因可能同時受CREB5所調控。為了進一步篩選這些上調基因中參與了腫瘤相關信號通路的基因,將這些基因與在癌癥通路富集類中起著富集作用的上調基因取交集,得到了16個基因,這16個基因所構成的分子網絡相關度最高的分子功能為細胞遷移,主要涉及CSF1R、MMP9、PDGFRB、FIGF和IL6這5個基因所構成的子網絡。因此這 5個基因可能是CREB5在大腸癌轉移過程中所調控的關鍵基因。本研究通過了生物信息學方法分析了大腸癌表達譜數據,發(fā)現 CREB5可能通過調控 CSF1R、MMP9、PDGFRB、FIGF和IL6這5個基因影響大腸癌細胞的遷移(圖3)。因此,CREB5可能是大腸癌轉移相關信號調控網絡中的關鍵調控點,靶向此蛋白的藥物有望能夠在一定程度上抑制大腸癌轉移。

圖3 CREB5調控大腸癌轉移機制模式圖

[1]Subramanian A,Kuehn H,Gould J,Tamayo P,Mesirov JP.GSEA-P: a desktop application for gene set enrichment analysis. Bioinformatics,2007,23(23): 3251–3253.

[2]齊魯,丁彥青. 大腸癌轉移相關基因表達調控的生物信息學分析. 基因組學與應用生物學,2013,(1): 83–90.

[3]Tusher VG,Tibshirani R,Chu G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(9): 5116–5121.

[4]Tonon L,Touzet H,Varre JS. TFM-Explorer: mining cis-regulatory regions in genomes. Nucleic Acids Res,2010,38(S2): W286–W292.

[5]Qi L,Ding YQ. Screening and regulatory network analysis of survival-related genes of patients with colorectal cancer.Sci China Life Sci,2014,57(5): 526–531.

[6]齊魯,丁彥青. 大腸癌患者生存相關基因的篩選與網絡調控分析. 中國科學(生命科學),2014,44(5): 481–487.

[7]Zu YL,Maekawa T,Nomura N,Nakata T,Ishii S. Regulation of trans-activating capacity of CRE-BPa by phorbol ester tumor promoter TPA. Oncogene,1993,8(10):2749–2758.

[8]Nomura N,Zu YL,Maekawa T,Tabata S,Akiyama T,Ishii S. Isolation and characterization of a novel member of the gene family encoding the cAMP response element-binding protein CRE-BP1. J Biol Chem,1993,268(6): 4259–4266.

[9]Jenuth JP. The NCBI. Publicly available tools and resources on the Web. Methods Mol Biol,2000,132:301–312.

[10]Barrett T,Troup DB,Wilhite SE,Ledoux P,Rudnev D,Evangelista C,Kim IF,Soboleva A,Tomashevsky M,Edgar R. NCBI GEO: mining tens of millions of expression profiles--database and tools update. Nucleic Acids Res,2007,35(S1): D760–D765.

[11]Kanehisa M,Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res,2000,28(1): 27–30.

[12]Hess J,Angel P,Schorpp-Kistner M. AP-1 subunits: quarrel and harmony among siblings. J Cell Sci,2004,117(Pt 25): 5965–5973.

[13]Mostafavi S,Ray D,Warde-Farley D,Grouios C,Morris Q. GeneMANIA: a real-time multiple association network integration algorithm for predicting gene function. Genome Biol,2008,9(Suppl.1): S4.

[14]Zhang B,Kirov S,Snoddy J. WebGestalt: an integrated system for exploring gene sets in various biological contexts. Nucleic Acids Res,2005,33(S2): W741–W748.