周坤,張今今

陜西師范大學生命科學學院,秦巴山區(qū)可持續(xù)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，西安 710062

高等植物的生長發(fā)育分為營養(yǎng)生長和生殖生長兩個階段。條件適宜時,植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉換,精確的開花時間是植物成功有性繁殖的前提。植物花發(fā)育是極其復雜的調控網(wǎng)絡,涉及開花轉換、花原基分化和花器官發(fā)育等過程。對擬南芥(Arabidopsis thaliana) 晚花突變體的研究表明,調節(jié)植物開花轉換(Floral transition)的 4個主要途徑是：光周期途徑、春化作用途徑、赤霉素途徑和自主調節(jié)途徑[1～3],其中光周期途徑和春化作用途徑依賴外源信號的刺激,而赤霉素途徑和自主調節(jié)途徑主要涉及內源信號的調節(jié)[4]。

一氧化氮( Nitric oxide,NO)是一種脂溶性和微水溶性小分子氣體,過去一直被認為是有毒分子,直到1998年諾貝爾生理學醫(yī)學獎授予了在動物NO信號轉導途徑方面做出突出貢獻的 3位科學家。此后人們逐漸發(fā)現(xiàn)作為一個非傳統(tǒng)信號分子,NO廣泛參與了動物的神經(jīng)傳遞、血管緊張性、基因轉錄、mRNA翻譯和蛋白的翻譯后修飾等調節(jié)過程[5]。同年, Delledonne等[6]和 Durner等[7]發(fā)現(xiàn) NO也能參與植物的防御反應,自此植物學界開始了植物 NO合成及其功能方面的研究。后續(xù)研究表明,NO是植物體內一種關鍵的信號分子,參與植物花發(fā)育、光合作用、氣孔運動、呼吸作用、種子萌發(fā)、細胞死亡及對外界環(huán)境的應激反應等生理過程[8～11]。然而NO在這些過程中的信號轉導途徑卻不是很清楚[12],同樣,對于植物開花轉換和花器官發(fā)育中內源 NO的功能也知之甚少。本文將結合植物 NO合成途徑的主要研究結果,對其在花發(fā)育進程中的作用和調節(jié)機制進行總結和評述。

1 植物NO的生物合成

已有眾多研究表明植物中有內源 NO的合成,但對植物NO合成機制的理解還不完善。與動物NO合成不同的是,植物有多條潛在的NO合成途徑,包括一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)、硝酸還原酶(Nitrate reductase,NR)和黃嘌呤氧化還原酶(Xanthine oxidoreductase ,XOR)催化途徑等[13,14]。

1.1 一氧化氮合酶催化途徑

在哺乳動物中,NO通過一氧化氮合酶催化底物L-精氨酸、NAD(P)H和氧氣產(chǎn)生。動物中有3種NOS,包括存在于各種細胞中的內皮NOS(Endothelial NOS,eNOS)和最早在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元 NOS(Neuronal NOS,nNOS),它們均屬組成型表達; 第三種誘導型NOS(Inducible NOS,iNOS) 是一種誘導酶,僅在脂多糖或干擾素誘導時表達[15,16]。

植物中是否存在類哺乳動物 NOS？植物內源NO合成是否類似于哺乳動物？這些都還只是猜測。1996年在白羽扇豆(Lupinus albus L.)根和根瘤中首次檢測到 NOS活性,且能被 NOS抑制劑 NG-甲基-L-精氨酸 (NG-monomethyl-L-arginine,L-NMMA)所抑制,自此研究者認為植物中也應當存在類哺乳動物 NOS[17]。在早期,線粒體甘氨酸脫羧酶復合物變異P蛋白和擬南芥線粒體蛋白被認為可能是高等植物中的NOS候選蛋白,但隨后發(fā)現(xiàn)它們并不直接參與植物 NO的合成[18～20]。其中擬南芥 NO合酶(AtNOS1)具有保守的 GTPase域,更有可能是一個功能性 GTP酶,因此被重命名為 AtNOA1(Nitric oxide associated 1)。但是,在擬南芥中能檢測到NO合成的穩(wěn)定中間物N-羥基精氨酸(N-hydroxyarginine,NOHA),因此推測AtNOA1至少能利用NOHA間接催化合成NO[21～23]。Hong等[24]基于AtNOA1基礎序列連配和結構特征,推測AtNOA1可能作為GTP酶參與植物線粒體內核糖體的合成或轉移,而線粒體正是植物 NO的主要來源之一,因此擬南芥突變體atnos1中內源 NO減少可能是由于缺乏 AtNOA1(AtNOS1),由此也說明AtNOA1在植物NO合成中具有重要功能。L-精氨酸是哺乳動物NOS合成NO的重要底物,因此植物中是否存在依賴 L-精氨酸合成NO的酶,是發(fā)現(xiàn)類動物NOS的重要證據(jù)。少數(shù)情況下,植物NOS-Like蛋白可基于瓜氨酸反應,但特定的組織器官中仍能檢測到依賴 L-精氨酸合成NO 的酶活性[25～28]。例如,植物過氧化物酶體的類NOS活性遠高于天然提取物中的類NOS活性,動物NOS抑制劑也能降低過氧化物酶體的類NOS活性[29];另外,在動物中廣泛應用的 L-精氨酸類似物——Nω-硝基-L-精氨酸甲基酯 (Nω-nitro-L-arginine methylester,L-NAME) 也能抑制植物NO的合成,這些研究都暗示植物中存在類動物 NOS[30]。需要強調的是：以上實驗都是假定類動物NOS為靶蛋白,因此在植物中找到 NOS抑制因子確切作用的靶蛋白非常重要[31,32]。盡管以上實驗都無法直接證實植物NOS的存在,但多種間接證據(jù)仍表明了植物中具有依賴 L-精氨酸的NO合成酶的可能性。

早期被認為是植物 NOS候選蛋白的線粒體甘氨酸脫羧酶復合物變異 P蛋白和 AtNOS1與動物NOS序列同源性都很低,擬南芥中也未發(fā)現(xiàn)與動物NOS顯著同源的基因[17～19]。但基于植物內源NO合成的事實和諸多實驗證據(jù),有學者認為植物NOS與哺乳動物NOS間序列相似性不應太低,前者應至少包含底物參與氧化還原反應的氧化酶和還原酶結構域[5]。因此推測植物NOS的功能域有可能在不同的多肽上,當受到特定信號刺激,這些多肽會自行組合并催化L-精氨酸等底物合成NO[33]。若果真如此,這可能就是尚未能在植物中找到動物NOS同源物的原因,也會使植物NOS的尋找和識別變得更為困難。

1.2 硝酸還原酶催化途徑

植物中除了可能的NOS酶催化途徑外,還有其他 NO合成機制,其中研究最為清楚的是植物硝酸還原酶途徑。細胞溶質中的 NR是高等植物同化硝酸鹽的關鍵酶,主要功能是利用電子供體 NADPH將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。對大豆 NR突變體的研究發(fā)現(xiàn),無論在體內還是體外 NR都以鉬輔因子(Molybdenum cofactor,MoCo)為催化位點,通過一個依賴NAD(P)H的反應催化亞硝酸鹽合成NO。NR缺陷的雙突變體nia1nia2中亞硝酸鹽和NO均有減少,而亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NiR)的反義轉基因株系中亞硝酸鹽和 NO卻均得到積累[34,35]。雖然NR催化亞硝酸鹽合成NO僅為還原硝酸鹽活性的1%[36～38],但NR途徑仍是植物NO合成的重要來源。

NR酶催化NO合成途徑受眾多因素影響。首先是硝酸鹽的競爭性抑制,NR催化的NO合成需要較低的硝酸鹽和較高的亞硝酸鹽,正常條件下植物體內硝酸鹽含量高(1～5 mmol/L)而亞硝酸鹽含量很低(10μmol/L),NR不會催化NO的合成,只有在厭氧條件下亞硝酸鹽含量增加,可導致 NO釋放量劇增100倍[35]; 其次,低pH值能使細胞內質體NiR活性受到抑制而使亞硝酸鹽積累[39],進而激活NR使NO的產(chǎn)量明顯增加; 再次,NR酶的翻譯后修飾也影響NO的產(chǎn)生,當NR蛋白激酶磷酸化NR中的保守絲氨酸,14-3-3蛋白即綁定到磷酸化的NR酶上,使NR以一種依賴Mg2+和Ca2+的形式失活和降解[40]。最后,NR介導的NO合成還受多種生物或非生物因子誘導,如致病疫霉菌(Phytophthora infestans (Mont.) de Bary )激發(fā)素 INF1[41]、滲透脅迫[42]、水脅迫[43,44]、多胺[45]、開花轉換[11]和低氧條件[46,47]等等。鑒于以上NR合成NO的機制及植物在多種情況下依靠NR合成NO的事實,可以認為植物中的NR更類似于哺乳動物中的組成型NOSs,保證植物基本的內源NO合成[48]。

1.3 其他途徑

除以上兩種途徑外,煙草(Nicotiana tabacum L.)中一個能與根部質膜特異性結合的亞硝酸:NO還原酶(Plasma membrane-bound nitrite：NO reductase,NiNOR)也能催化亞硝酸鹽合成NO。體外試驗發(fā)現(xiàn),NiNOR 介導 NO合成的電子供體來源可能不是NAD(P)H[49],且需要相對較低的pH環(huán)境。NiNOR還能與質膜束縛的 NR相互協(xié)調作用,在質外體中還原 NR合成的亞硝酸鹽,并認為煙草根中的 NR:NiNOR系統(tǒng)與土壤中可利用硝酸鹽的感應有關[50]。

此外,植物過氧化物酶體中的黃嘌呤氧化還原酶也能將亞硝酸鹽還原為 NO。XOR有兩種可以互換的形式：過氧化物誘導的黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)和黃嘌呤脫氫酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)[51,52],在豌豆(Pisum sativum L. )葉中XOD約占70%[53],低氧條件下,XOD可將亞硝酸鹽還原成NO,而有氧條件下,XOD催化反應的主要產(chǎn)物則是尿酸和過氧化物[54]。

2 植物NO對花發(fā)育的調節(jié)

2.1 植物NO與開花轉換

植物開花是一個受外源環(huán)境和內源信號共同調控的過程,復雜而有序的調節(jié)系統(tǒng)能確保植物在適宜條件下開花并保證物種的生殖延續(xù)。以往對植物成花機制的研究主要集中在4個成花途徑以及花器官決定基因方面,如光周期途徑、春化作用途徑、赤霉素途徑和自主調節(jié)途徑[1～3]。之后,擬南芥 NO大量合成突變體nox1的成功篩選,發(fā)現(xiàn)了NO對開花的抑制作用。He等[10]發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比,nox1中有更多NO合成底物L-精氨酸和中間產(chǎn)物L-瓜氨酸,NO釋放量增加,同時表現(xiàn)為蓮座葉數(shù)增多和晚花。這些現(xiàn)象無疑加深了人們對開花的理解,同時也增加了開花調控的復雜性。

如圖1所示,本文將結合He等[10]和其他的相關研究初步解析 NO抑制開花的分子機制。在擬南芥開花途徑中,開花整合因子(Floral pathway integrator),AGAMOUS-LIKE24 (AGL24)、FLOWERING LOCUS T (FT)和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 (SOC1)等能通過信號傳遞把各個開花途徑的效應聚集到花分生組織決定基因APETALA1(AP1)和LEAFY (LFY)上。AP1和 LFY在開花轉換之前表達逐步增加,最終促使植物花芽分化形成[4,55～57]。在光周期途徑中,CONSTANS (CO)作為最下游元件,起聯(lián)系晝夜節(jié)律和花分生組織形成的重要作用[58,59]。當晝夜節(jié)律中央調控組分TIMING OF CAB EXPRESSION (TOC1) 和 CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1(CCA1)正常表達時,內源NO可抑制晝夜節(jié)律到光周期途徑的信號傳遞[60,61],從而使 GIGANTEA(GI)及其下游的 CO基因表達相應減少,CO的低表達使LFY基因表達下調,植株營養(yǎng)生長延長并表現(xiàn)出蓮座葉數(shù)增加和晚花。通常野生型擬南芥在長日照下正常開花,短日照下晚花,而NO大量合成突變體nox1在長日和短日條件下都表現(xiàn)晚花,且晚花時間比野生型在短日條件下更為延遲[10],進一步證明了NO對開花的抑制作用。

對自主調節(jié)途徑的研究發(fā)現(xiàn),擬南芥自主調節(jié)途徑突變體(Autonomous pathway mutants)具有晚花表型的同時,開花抑制基因 FLOWERING LOCUS C(FLC)表達上調[62],并且野生型、突變體 nox1和Atnos1中FLC的表達量多少與它們各自的開花時間的早晚對應一致[59],說明 NO也參與了自主調節(jié)途徑的調控[63]。由此可見,NO對開花轉換的調控作用,除光周期途徑外至少還涉及自主調節(jié)途徑。雖然還不清楚 NO在該途徑中抑制開花的詳細機制,但可以確定的是,內源 NO可能通過下調自主調節(jié)途徑組分活性(Activity or expression of autonomous pathway components)或提高一系列促進FLC表達必須因子(A collection of factors required to promote FLC expression)的活性而上調 FLC的表達,最終的效應都作用到開花促進因子LFY上,抑制LFY表達,延遲開花[64]。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn),硝酸還原酶缺陷雙突變體 nia1nia2中不僅內源 NO合成較少,同時表現(xiàn)為莖葉數(shù)/蓮座葉數(shù)比率上升,抽苔和開花時間縮短[11],也說明了NO對開花轉化的抑制作用。

圖 1 NO 抑制植物開花(根據(jù)文獻[10,55,57,64,65]整理)

除NO以外,14-3-3蛋白家族也參與到植物開花轉換的調控網(wǎng)絡中調節(jié)植物開花。14-3-3蛋白家族在真核生物多個信號途徑中起作用,調節(jié)一系列生物應答反應。其信號通路作用最普遍的方式是14-3-3蛋白二聚體與磷酸化的靶蛋白綁定并調節(jié)其表達[66]。擬南芥14-3-3蛋白μ和υ在光感應和光應答中具有重要作用,它們與光周期途徑中心調控因子CO蛋白結合促進FT的表達[57,67],FT蛋白作為可移動的開花信號‘成花素’中的一個重要組分,能與轉錄因子FD結合上調花分生組織決定基因AP1從而促進擬南芥開花。但是在水稻(Oryza sativa L.)中,過表達的GF14c(A G-box factor 14-3-3c protein) 蛋白卻通過與FT同源基因編碼的Hd3a蛋白結合的方式,阻止后者在篩管內和細胞間自由移動,進而抑制水稻開花[68]。另有研究還表明,14-3-3蛋白還與NR的活性密切相關[40,44],它能綁定到磷酸化的 NR酶上,使 NR以依賴 Mg2+和 Ca2+的形式失活和降解[40]。因此,14-3-3蛋白對植物開花轉換究竟起促進作用還是抑制作用,以及是否通過調控NR影響NO合成并進而調控植物開花仍不清楚。

綜上所述,NO對擬南芥開花起抑制作用,但其開花調控的直接方式和生物學意義仍不很清楚; 另外,NO在光周期和自主調節(jié)途徑中的具體調控機制也了解甚少,其中NO調控FLC表達涉及的中間作用元件更是個謎; 此外,NO合成還受生物和非生物刺激調節(jié),例如低溫和冷凍脅迫、滲透脅迫和病毒侵染都會促使 NO合成[69,70,42],雖然還不清楚這些逆境誘導下的 NO與抑制開花的直接關系,但不排除植物在脅迫條件下通過合成 NO抑制開花,避免在不適條件下繁殖后代的可能性; 最后,NO抑制開花轉換是否具有普遍性仍需在其他開花植物中開展驗證性研究。

2.2 NO與花粉萌發(fā)和花粉管延伸的關系

授粉受精是開花植物有性生殖的基本環(huán)節(jié),有活力的花粉粒轉移到柱頭萌發(fā)、花粉管定向生長和花粉雌蕊間相互作用的完成是成功受精和種子形成的必要條件[71,72]。通常具有親和性的花粉粒被柱頭接受,吸水膨脹,內壁經(jīng)外壁上的萌發(fā)孔向外突出形成花粉管?；ǚ酃芤砸环N典型的極性細胞擴增形式延伸,延伸活動幾乎專一定位在花粉管頂部并需要大量的蛋白質和多糖來維持質膜和細胞壁的迅速擴張[72,73]。

NO對植物開花轉換的抑制效應引起了學者對NO在花發(fā)育中作用的興趣。Seligman等[11]通過對擬南芥花發(fā)育過程中NO表達模式的研究,發(fā)現(xiàn)NO只在特異組織和細胞中合成且合成量隨著花發(fā)育進程不斷增加直至開花。在nia1nia2雙突變體中,NO的合成量雖然大幅減少,但 NO釋放模式卻沒有改變。在四輪花器官中,萼片和花瓣無NO合成,而雌蕊的NO合成僅發(fā)生在柱頭的乳突上,雄蕊的NO合成也只特異地發(fā)生在即將分化為花粉粒的成熟小孢子中,由此可見NO與授粉、花粉粒萌發(fā)及花粉管的生長密切相關。對百合(Lilium longiflorum Thunb. )的研究發(fā)現(xiàn),NO對花粉管延伸有重要作用,花粉管頂端的 NO濃度調節(jié)著花粉管延伸的速率和方向。在外源高濃度 NO誘導下,花粉管延伸速率降低且生長軸方向發(fā)生改變,但隨后恢復正常生長[73]。

另有關于NO供體、UV-B和逆境脅迫等方面的研究也表明,NO與花粉萌發(fā)和花粉管延伸的作用關系密切。經(jīng) S-亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO)和硝普酸鈉(Sodium nitroprusside,SNP)等NO供體處理的黃瓜(Cucumis sativus L.),花粉萌發(fā)和花粉管延伸表現(xiàn)出一種劑量依賴模式的抑制現(xiàn)象[74]。大多數(shù)植物的花粉粒萌發(fā)和花粉管延伸可被 UV-B抑制,UV-B的作用機理似乎也涉及到NO的信號傳遞[75～77],如萌發(fā)的紫花泡桐(Paulownia tomentosa(Thunb.) Steud. )花粉暴露在UV-B下能提高NO的合成量[77]。雖然 NO清除劑 2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazole-1-oxyl 3-oxide (cPTIO)和動物NOS抑制劑L-NAME對花粉萌發(fā)和花粉管延伸都無明顯作用,但這些物質卻能部分解除UV-B、GSNO和SNP對花粉萌發(fā)和花粉管延伸的抑制作用。此外,這些抑制效應還能被可溶性鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑阻斷,表明在 NO抑制花粉和花粉管延伸的信號通路中有環(huán)鳥苷酸(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)參與[74]。例如,百合花的花粉管延伸和茶樹受低溫抑制的花粉萌發(fā)與花粉管延伸均涉及cGMP信號途徑[73,78,79]。

綜上所述,NO供體、UV-B和低溫脅迫等促使花粉粒和花粉管中 NO的大量合成,NO信號經(jīng)由cGMP途徑傳導,最后抑制花粉萌發(fā)和花粉管延伸并調節(jié)花粉管的延伸方向。另有研究表明,野生型擬南芥花粉管延伸到離胚珠孔約10μm處會重新調整延伸方向進入胚珠[80],由于缺乏既不損傷胚珠又能準確測定胚珠 NO含量的技術,所以花粉管調整方向進入胚珠是否與 NO合成量有關仍需進一步研究[73]。

3 結語與展望

NO作為重要的信號分子,參與了植物生長發(fā)育的多個過程,但植物內源 NO合成的確切機制仍不是很清楚。雖然普遍認為植物 NOS基因與動物NOS基因存在一定的同源性,且在植物中也能檢測到NOS-Like活性,但目前仍未發(fā)現(xiàn)植物特有的NOS基因或依賴 L-精氨酸的 NO合成途徑,這就極大地限制了植物 NO信號通路的研究。因此,尋找植物“NOS基因”仍是一個極具挑戰(zhàn)性的有和意義的課題。鑒于動植物的差異,在基于動物NOS進行類比研究時應當建立更合理的模型和方法,其中生物信息學和基因組學的進展有可能對植物NOS基因的尋找?guī)硪欢ǖ膸椭?/p>

植物花發(fā)育涉及眾多基因表達和信號傳導途徑,內源 NO的參與無疑增加了成花轉變和花發(fā)育調控的復雜性。這既加深了對花發(fā)育的理解,也提醒人們用更加系統(tǒng)宏觀的理念研究NO信號通路。顯然,目前對 NO信號在花發(fā)育過程中的調控機制還了解甚少,例如開花轉換中 NO對光周期途徑和自主調節(jié)途徑的具體作用機制并不清楚; NO在花發(fā)育過程中的直接作用靶和 NO信號通路中關鍵次級信使分子的鑒定也亟需解決; 在花粉萌發(fā)和花粉管延伸中,NO作用涉及的信號途徑也需要進一步研究等。今后隨著植物 NO合成途徑的深入研究,必將推動植物花發(fā)育過程中 NO調控機制的進一步揭示,也會促進和加深人們對植物開花過程的解讀。

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