冉茂良,陳斌,尹杰 ,楊岸奇,蔣明

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長沙 410128;

2. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心,農(nóng)業(yè)部中南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站,長沙 410125;

3. 中國科學(xué)院研究生院,北京 100049

1993年 Lee等[1]首次在線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)了 microRNA (miRNA)—Lin-4基因,Reinhart等[2]于2000年發(fā)現(xiàn)了線蟲的另一個(gè)miRNA—Let7基因及其靶基因lin-41,并證實(shí)了它們在線蟲發(fā)育過程中的時(shí)間控制作用。之后,科研人員開始廣泛關(guān)注 miRNA這一全新的后轉(zhuǎn)錄基因沉默的重要調(diào)節(jié)因子,其調(diào)節(jié)機(jī)制主要是通過堿基互補(bǔ)配對原則與靶mRNA結(jié)合后形成雙鏈RNA,從而誘導(dǎo)靶mRNA降解或抑制其翻譯過程[3,4]。目前miRBase已經(jīng)收錄了多種生物的 miRNA,大量研究證實(shí)miRNA在生物體生長、發(fā)育和凋亡等過程中具有重要的調(diào)控意義[5]。同生物體其他器官和組織一樣,睪丸的正常發(fā)育和精子生成也會受到激素、生長因子和酶或蛋白質(zhì)的嚴(yán)格調(diào)控[6],研究表明,miRNA也調(diào)控著睪丸的正常發(fā)育和精子生成過程。目前,動(dòng)物睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān) miRNA的研究方法主要集中在綜合利用各種探針設(shè)計(jì)和標(biāo)記技術(shù),同時(shí)結(jié)合微陣列芯片、高通量測序、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR等技術(shù)以提高檢測通量、靈敏度和特異性[7]; 研究的主要內(nèi)容多集中于睪丸 miRNA表達(dá)的種屬差異性和階段特異性、睪丸 miRNA的表達(dá)調(diào)控以及一些miRNA對精子生成的調(diào)節(jié)作用。本文綜述了近年來睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān)miRNA的研究進(jìn)展,以期為后續(xù)的相關(guān)研究提供參考。

1 睪丸miRNA表達(dá)的物種差異性

動(dòng)物體內(nèi)許多miRNA的表達(dá)模式是固定的,但在不同物種和組織中這種固定的表達(dá)模式卻存在著差異。通過對人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和荷斯坦牛(Holstein Friesian)等動(dòng)物不同組織miRNA表達(dá)譜的比較發(fā)現(xiàn),miRNA在睪丸中的表達(dá)存在特異性,主要表現(xiàn)為種類和數(shù)量上的差異(表 1)[8～10]。

研究 miRNA組織特異性表達(dá),也有助于解析miRNA在不同器官和組織中的功能。Liu等[8]對人不同組織中161個(gè)miRNA的表達(dá)情況采用基因芯片技術(shù)、Real-time PCR、Northern blot和文獻(xiàn)檢索進(jìn)行了研究,證實(shí)miRNA在人體組織中的表達(dá)具有特異性,并且在人體睪丸組織中檢測到 112種特異性表達(dá)的 miRNA。Mishima等[9]對成年小鼠睪丸和卵巢的miRNA文庫進(jìn)行了測序,研究miRNA在生殖系統(tǒng)中的表達(dá)特點(diǎn),利用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明 miRNA在組織中的表達(dá)具有特異性,并檢測到49種僅在或主要在成年小鼠睪丸組織中表達(dá)的miRNA。Huang等[10]采用 Solexa高通量測序技術(shù)對荷斯坦牛睪丸和卵巢中的 miRNA文庫進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛睪丸中有21個(gè)miRNA存在特異性表達(dá)。由此可見,睪丸miRNA在不同物種的表達(dá)存在特異性。

生物技術(shù)的不斷發(fā)展有助于在睪丸組織中發(fā)現(xiàn)更多特異性表達(dá)的miRNA,例如高通量測序技術(shù)、miRNA表達(dá)圖譜分析和生物信息學(xué)技術(shù)等[11～13]。Wu等[11]構(gòu)建了成年奶山羊(Capra hircus L.)睪丸組織miRNA文庫,利用 Illumina高通量檢測技術(shù),通過與miRBase 19.0中牛、羊的miRNA對比,在奶山羊睪丸組織中確定了373種保守的miRNA,并發(fā)現(xiàn)91種新配對的 miRNA,利用 qRT-PCR證實(shí)其中的 6種 miRNA(miR-10b、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-34c、miR-449b和miR-1468)特異性表達(dá)于奶山羊睪丸組織,并且有128種保守的miRNA在奶山羊的睪丸發(fā)育和精子生成的減數(shù)分裂過程中發(fā)揮作用。Yang等[12]采用 Solexa高通量測序技術(shù)對人正常睪丸組織的miRNA進(jìn)行了測序,檢測出770個(gè)已知的和 5個(gè)新的 miRNA,并利用 qRT-PCR驗(yàn)證了其中15個(gè)已知的(let-7f-5p、let-7a-5p、miR-34c-5p、miR-22-5p、let-7c、miR-10b-5p、miR-514b-5p、miR-34b-5p、miR-15b-5p、miR-27b-3p、miR-134、miR-15a-5p、miR-889、miR-506-3p、miR-17-5p)和5個(gè)新的 miRNA(HT-0117-3p、HT-0016-3p、HT-0072-3p、HT-0041-3p、HT-0010-5p),證實(shí)了Solexa高通量測序結(jié)果的可靠性。Abu-Halima等[13]采用 miRNA陣列分析法,發(fā)現(xiàn)與正常睪丸組織相比,病變組織中共有 211種 miRNA存在差異表達(dá),而且qRT-PCR驗(yàn)證的結(jié)果與miRNA陣列分析結(jié)果一致。

表1 睪丸特征性表達(dá)的miRNA

2 睪丸miRNA表達(dá)的階段特異性

動(dòng)物的睪丸發(fā)育大體上經(jīng)歷胎兒期、幼年期、青年期和性成熟期 4個(gè)階段,但不同動(dòng)物睪丸發(fā)育的階段又有一些相對細(xì)致的劃分[14]。miRNA在睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)模式也呈現(xiàn)出特異性,主要是數(shù)量和種類上的特異性,其正常的表達(dá)模式是睪丸發(fā)育和生精功能正常的前提。此外,研究睪丸miRNA表達(dá)的階段特異性也能從側(cè)面證實(shí) miRNA對睪丸的發(fā)育、成熟和精子生成具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前多采用基因芯片技術(shù)、高通量測序技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及qRT-PCR對睪丸miRNA表達(dá)的階段特異性進(jìn)行研究,但基于動(dòng)物模型和睪丸發(fā)育時(shí)期不盡相同,所采用的實(shí)驗(yàn)方法也有所差異。

Yan等[15]采用基因芯片技術(shù)對小鼠幼齡期(7 d)和成年期(56 d)睪丸中miRNA的表達(dá)進(jìn)行了比較研究,利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)19種miRNA的表達(dá)存在顯著差異,在幼齡小鼠中 14種miRNA(miR-411、miR-495、miR-335、miR-434-5p、miR-337、miR-379、miR-127、miR-376a、miR-181d、miR-214、miR-181c、miR-361、let-7e、miR-181b)的表達(dá)被顯著上調(diào),5種miRNA(miR-34a、miR-29b、miR-449、miR-34b和 miR-34c)的表達(dá)被顯著下調(diào)。Lian等[16]通過構(gòu)建miRNA文庫和Solexa高通量測序技術(shù)對軍牧-1豬(Sus scrofa)幼齡期(30 d)和成年期(180 d)睪丸中miRNA的表達(dá)進(jìn)行了比較研究,共發(fā)現(xiàn) 469種 miRNA,其中新發(fā)現(xiàn) 15種豬特有的miRNA,56種新的候選 miRNA; 在 469種 miRNA中有 122種在幼齡期和成年期的表達(dá)顯著不同,其中對隨機(jī)選取的10種miRNA(miR-9-1、miR-183、miR-122、miR-145、miR-30a、miR-199b*、let-7c、miR-221、miR-323和 miR-196)進(jìn)行了 qRT-PCR驗(yàn)證,其結(jié)果與 Solexa測序分析結(jié)果基本一致,僅miR-9-1和miR-196的兩個(gè)結(jié)果趨勢一致。Lou等[17]采用miRNA芯片技術(shù)對長白豬青年期(60 d)和成年期(180 d)睪丸中 miRNA 的表達(dá)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)129種miRNA的表達(dá)存在顯著差異,在成年期有51種miRNA的表達(dá)上調(diào),78種miRNA的表達(dá)下調(diào),對隨機(jī)選取的 9 種 miRNA(miR-663、miR-1、miR-762、miR-143、miR-638、miR-145、miR-542-3p、miR-155和miR-705)進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證,其中僅miR-145呈現(xiàn)出相反的表達(dá)譜,其余8種miRNA的表達(dá)譜均相同,證明兩種方法所得的結(jié)果具有較高的一致性。Torley等[18]采用生物信息學(xué)技術(shù)和 Real-time PCR技術(shù)研究并驗(yàn)證了綿羊(Ovis aries L.)妊娠胎兒在妊娠初期(第42 d)和中期(第75 d)睪丸中miRNA的表達(dá),共發(fā)現(xiàn) 30 種 miRNA的表達(dá)存在顯著差異,其中 13種 miRNA(miR-302d、miR-200c、miR-222、miR-200b、miR-362、miR-99b、miR-485-5p、 miR-382、miR-149、miR-15b、miR-92、miR-17-5p和 miR-107)在妊娠初期的表達(dá)顯著升高,17種 miRNA(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-33、miR-211、miR-193a、miR-19a、miR-19b、miR-199b、miR-27a、miR-199a、miR-143、let-7g、miR-22、miR-30e-5p、miR-204、miR-30b和let-7e)在妊娠中期的表達(dá)顯著升高。Zhang等[19]采用芯片技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)研究并驗(yàn)證了人在新生、成年(25歲)和老年(75歲)3個(gè)不同時(shí)期睪丸中miRNA的表達(dá),發(fā)現(xiàn)新生胎兒、成年人和老年人睪丸中分別有 251、109和 125種miRNA表達(dá),有127種miRNA(如miR-375、miR-208、miR-494、miR-425和 miR-198等)特定表達(dá)于新生胎兒睪丸中,而僅有3種(miR-24、miR-27、miR-21)和2種(miR-221、miR-222)miRNA特定表達(dá)于成年和老年人的睪丸中,此外有 106種 miRNA(如miR-125b、miR-143、miR-23b和 miR-26a等)廣泛表達(dá)于人體睪丸的這3個(gè)階段。

綜上所述,目前多采用在高通量克隆測序和基因芯片技術(shù)等基礎(chǔ)上利用RT-PCR或qRT-PCR對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,研究睪丸中miRNA表達(dá)的階段特異性。但是基于取樣的方式、樣本量以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證量等因素的限制,研究結(jié)果與miRNA在實(shí)體中的表達(dá)模式會有不同程度的差異,從而對描繪睪丸miRNA在實(shí)體中的表達(dá)狀況造成一定程度的困難,有待于科研工作者進(jìn)一步研究制定更為合理的方法以研究睪丸miRNA的表達(dá)模式。

3 睪丸miRNA的表達(dá)調(diào)控

睪丸 miRNA不僅對睪丸基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)功能,其自身的表達(dá)也會受到細(xì)胞內(nèi)外相關(guān)因素的調(diào)控,從而對睪丸發(fā)育和精子生成產(chǎn)生影響。目前,關(guān)于睪丸miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的研究相對較少,但也有一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)外的一些因素(例如激素、轉(zhuǎn)錄因子、酶和蛋白等)可以調(diào)控睪丸中miRNA的表達(dá)。

研究表明,激素可以調(diào)節(jié)睪丸細(xì)胞miRNA的表達(dá)。Hu等[20]采用芯片技術(shù)和 qRT-PCR技術(shù)證實(shí)了大鼠的一些睪丸類固醇生成細(xì)胞中的 miRNA受激素調(diào)節(jié),并且其中的一些miRNA受到多個(gè)激素的調(diào)控; 促腎上腺皮質(zhì)激素(Adreno cortico tropic hormone,ACTH)上調(diào) miR-212、miR-182、miR-183、miR-132和 miR-96而下調(diào) miR-466b、miR-214、miR-503 和 miR-27a 的表達(dá); 17α-雌二醇(17α-E2)上調(diào) miR-212、miR-183、miR-182、miR-132、miR-370、miR-377和 miR-96而下調(diào) miR-125b、miR-200b、miR-122、miR-466b、miR-138、miR-214、miR-503和 miR-27a的表達(dá); 地塞米松(dexamethasone)上調(diào)miR-183而下調(diào) miR-200b、miR-122、miR-19a、miR-466b 和 miR-27a 的表達(dá)。Panneerdoss等[21]研究表明,雄激素調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞中的一些miRNA的表達(dá)是通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞或生殖細(xì)胞特定基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的; 通過雄激素抑制和雄激素替代證實(shí)雄激素能夠調(diào)節(jié)小鼠睪丸支持細(xì)胞中一些 miRNA的表達(dá),上調(diào) miR-201、miR-547、miR-871-3p、miR-878-5p、miR-880、miR-463、miR-741、miR-471-5p、miR-753a、miR-375、miR-25、miR-34c、miR-203和 miR-449a而下調(diào) miR-18a*、miR-328、miR-335-3p和 miR-468的表達(dá)。此外,Dai等[22,23]敲除雄性小鼠圓形精子細(xì)胞中的GRTH基因(促性腺激素調(diào)節(jié)的睪丸特異 RNA 解旋酶基因)發(fā)現(xiàn),相比于正常小鼠,19個(gè)miRNA的表達(dá)水平顯著升高,包括Let-7家族、miR-470、miR-34c以及睪丸特異表達(dá)的 miR-469,miRNA的初級前體轉(zhuǎn)錄水平也顯著升高,如 pri-let-7d、pri-let-7g、pri-miR-34c、pri-miR-469以及pri-miR-470; 證實(shí)GRTH在睪丸精子細(xì)胞 miRNA的成熟過程中發(fā)揮著重要的負(fù)調(diào)控作用,以維持精子發(fā)生過程中成熟miRNA分子的動(dòng)態(tài)平衡,從而保證精原細(xì)胞能夠順利發(fā)育至成熟的精子。

酶或蛋白質(zhì)同樣也可以調(diào)節(jié)睪丸細(xì)胞 miRNA的表達(dá)。Wu等[24]研究表明,雄性生殖線中缺乏第2類核糖核酸酶Ⅲ不僅會阻礙成熟 miRNA的形成而且還會導(dǎo)致雄性不育。Tian等[25]研究表明,調(diào)低人惡性多發(fā)性畸胎瘤細(xì)胞(NTERA-2)中脆性 X智力低下蛋白(FMRP)的表達(dá)可以通過減弱 miR-383與FMRP之間的相互作用而增強(qiáng)miR-383對細(xì)胞分化的抑制作用,從而證實(shí)FMRP對miR-383的功能存在負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。Ali等[26]研究表明,APOBEC3(Apolipoprotein B mRNA-editing enzym,catalytic polypeptide like 3)能夠阻滯 DND1(一個(gè)RNA結(jié)合蛋白,可介導(dǎo)生殖細(xì)胞的存活,抑制生殖細(xì)胞腫瘤的形成)的功能以恢復(fù) miR-372和miR-206分別對LATS2和CX43基因的抑制作用,并證明APOBEC3能夠通過調(diào)節(jié)DND1的功能以調(diào)控細(xì)胞中miRNA介導(dǎo)的翻譯調(diào)控。此外,轉(zhuǎn)錄因子對睪丸細(xì)胞miRNA的表達(dá)也起著調(diào)節(jié)作用。Niu等[27]在證實(shí) miR-21對維持睪丸精原干細(xì)胞數(shù)量具有重要作用的基礎(chǔ)上,過表達(dá)Etv5基因(轉(zhuǎn)錄因子Ets差異基因5)可促進(jìn)miR-21表達(dá),從而證實(shí)ETV5(一種轉(zhuǎn)錄因子)對調(diào)節(jié) miR-21在睪丸精原干細(xì)胞中的表達(dá)具有重要作用。

4 miRNA對精子生成的調(diào)節(jié)作用

原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells,PGCs)來源于胚外上胚層或內(nèi)胚層,作為哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞系(Germ cell lineage)的起源,PGCs形成后即遷移至生殖嵴(胚胎性腺)并在來源于中胚層的體細(xì)胞之間定植,隨性腺的分化而大量增殖并分化,并逐漸過渡到前精原細(xì)胞(Prospermatogonia),隨后休眠于細(xì)胞周期的G1/G0期[28]。在動(dòng)物出生后的一段時(shí)間內(nèi),前精原細(xì)胞大量增殖并分化為精原細(xì)胞,并且也會有少量的精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)存在于精原細(xì)胞群體中以維持體內(nèi)精子發(fā)生[29]。精原細(xì)胞通過一次有絲分裂形成初級精母細(xì)胞、兩次減數(shù)分裂形成精子細(xì)胞,最終在經(jīng)歷一系列形態(tài)變化過程后形成成熟的精子。研究證實(shí)miRNA對精子生成具有重要的調(diào)控作用(表2),且這種調(diào)控作用貫穿于精子生成的整個(gè)過程中。如圖 1所示,目前關(guān)于 miRNA對原始生殖細(xì)胞至精原細(xì)胞的調(diào)控作用的研究較多,而對初級精母細(xì)胞至成熟精子細(xì)胞的研究還較少。

表2 對精子生成具有調(diào)控作用的miRNA

圖1 部分miRNA在精子生成過程中的作用位點(diǎn)(參考文獻(xiàn)[28]并修改)

調(diào)控PGCs增殖和發(fā)育的miRNA較多,如miR-19a[30]、miR-19b[30]、miR-141[31]、miR- 200a[31]、miR-200c[31]、 miR-let-7 家族(a,d,e,f,g)[31～33]、miR-17-92 簇[34]、miR-106b-25 簇[34]、miR-302-367外,miRNA通常以間接的方式對PGCs進(jìn)行調(diào)控,腫瘤抑制因子 PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是miR-19a和miR-19b的作用靶標(biāo)之一,而 PTEN可以負(fù)向調(diào)控 PGCs增殖[39,40],因此 miR-19a和 miR-19b可以通過調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)而調(diào)控 PGCs的增殖?；诓煌膍iRNA具有相同的靶標(biāo),因此 miRNA簇內(nèi)部成員miRNA以及miRNA簇之間均存在協(xié)同作用以調(diào)控PGCs的增殖和發(fā)育,miR-141、miR-200a和miR-200c屬于miR-200超家族成員,它們的種子序列相似,被認(rèn)為在 PGCs的增殖和發(fā)育過程中存在協(xié)同作用[38,31],此外Let-7家族、miR-125a和miR-9對共同的作用靶標(biāo)—LIN28(miRNA調(diào)節(jié)蛋白,一種高度保守的 RNA 結(jié)合蛋白)有類似的調(diào)控作用,從而推測它們對PGCs的調(diào)控存在協(xié)同作用[38]。

miRNA對由PGCs發(fā)育而來的精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞也有調(diào)控作用。對精原干細(xì)胞起調(diào)控作用的miRNA 有 miR-Let-7家族(7,a,b,c,d,e)[41]、miR-21[27]、miR-34c[42]、miR-148[33]等,對精原細(xì)胞起調(diào)控作用的 miRNA有 miR-106b-25簇[32]、miR-17-92 簇[32]、miR-221[44]、miR-222[44]和 miR-449[45]等。miRNA對精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞的調(diào)控也存在階段特異性。Huszar等[43]研究發(fā)現(xiàn),miR-146依賴維甲酸(Retinoic acid,RA)信號對精原干細(xì)胞的分化具簇[35]、miR-290-295 簇[36]、miR-323[31]和 miR-9[31,37]等。miRNA對PGCs的調(diào)控存在時(shí)相性,如miR-141、miR-200a、miR-200c和miR-323等調(diào)控PGCs的早期階段,而 miR-9等調(diào)控 PGCs的晚期階段[38]。此有重要的調(diào)節(jié)作用,其在未分化的精原細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平是分化過程中的精原細(xì)胞的180倍。miRNA對精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞的調(diào)控是通過調(diào)節(jié)靶標(biāo)而介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。Yang等[44]研究發(fā)現(xiàn),未分化的精原干細(xì)胞向分化狀態(tài)轉(zhuǎn)化的數(shù)量受到 KIT受體的調(diào)控,而miR-221和miR-222則會抑制KIT受體mRNA和蛋白表達(dá)量,從而在保持哺乳動(dòng)物的精原細(xì)胞處于未分化狀態(tài)中起著至關(guān)重要的作用; Bao等[45]研究發(fā)現(xiàn),miR-449和miR-34家族中的miR-34b/c共同作用于E2F轉(zhuǎn)錄因子視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白通路中的基因,從而實(shí)現(xiàn)對雄性生殖細(xì)胞的調(diào)控作用。此外,miRNA簇或miRNA也協(xié)同調(diào)控精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞的增殖與發(fā)育。Tong等[34]研究發(fā)現(xiàn),雄性生殖細(xì)胞中缺乏 miR-17-92簇時(shí)會使 miR-106b-25簇中的 miRNAs的表達(dá)量劇增,從而表明 miR-106b-25簇和 miR-17-92簇對精原干細(xì)胞的調(diào)控存在協(xié)同作用。

miRNA對精子生成過程中初級精母細(xì)胞至成熟精子細(xì)胞這一發(fā)生階段也存在調(diào)控作用。Yu等[46]研究發(fā)現(xiàn),miR-122a能夠調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞過渡蛋白2(TNP2)的表達(dá)而對精子生成的后期階段發(fā)揮調(diào)控作用。此外也有研究表明,miR-13可以通過增強(qiáng)生精細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)晚期精子發(fā)生[42]。miR-24通過作用于甲基化 CpG結(jié)合域蛋白6(MBD6)和組蛋白2A家族成員X(H2AX)兩個(gè)靶標(biāo),而在精子生成過程中的減數(shù)分裂時(shí)發(fā)揮潛在的調(diào)控作用[47]。miR-888對維持成熟精子的結(jié)構(gòu)和鞭毛的蠕動(dòng)具有重要的作用[48]。盡管后期減數(shù)分裂和單倍體生殖細(xì)胞是精子生成過程中產(chǎn)生 miRNA的主要源頭[49],但是目前關(guān)于 miRNA對精子生成過程中初級精母細(xì)胞至成熟精子細(xì)胞這一發(fā)生階段的調(diào)控作用的報(bào)道卻較少。此外,miRNA調(diào)控精子發(fā)生過程的階段或時(shí)相特異性以及其對精子發(fā)生的調(diào)控途徑也需進(jìn)一步研究。

miRNA不僅在動(dòng)物睪丸中的表達(dá)具有種屬差異性和發(fā)育階段特異性,其本身在睪丸中的表達(dá)受到來自體內(nèi)外各種因素的調(diào)控,而且對動(dòng)物精子生成也具有重要的調(diào)控作用。以 Let-7家族為例,對miRNA在動(dòng)物睪丸發(fā)育和精子生成過程中表現(xiàn)出的種屬和發(fā)育階段特異性以及其自身表達(dá)調(diào)控和對精子生成的調(diào)控作一詳細(xì)闡述。

Let-7家族成員主要包括 Let-7a-1、Let-7a-2、Let-7a-3、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7e、Let-7f-1、Let-7g、Let-7i以及miR-98等,已有研究表明Let-7家族對動(dòng)物細(xì)胞分裂分化、器官發(fā)育、心肺系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育均有調(diào)控作用[52]。此外,如前文所述,Let-7家族成員對動(dòng)物睪丸發(fā)育和精子生成也起著不同程度的調(diào)控作用。Let-7家族在睪丸中的表達(dá)存在物種差異,如表 1所示,Let-7家族中的miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-let-7a-3、miR-let-7b、miR-let-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g特異性表達(dá)于人的睪丸中,在小鼠的睪丸中僅有 let-7g-3p特異性表達(dá),而在荷斯坦牛睪丸中卻不存在特異性表達(dá)。Let-7家族在睪丸中的表達(dá)也存在階段特異性。Lian等[16]研究表明,Let-7c在軍牧-1豬幼齡期(30 d)和成年期(180 d)睪丸中的表達(dá)顯著不同; Torley等[18]研究表明,Let-7g和Let-7e在綿羊胎兒妊娠中期(第75 d)的表達(dá)顯著升高而在妊娠初期(第 42 d)卻未發(fā)現(xiàn)有顯著升高現(xiàn)象。Let-7家族在睪丸中的表達(dá)也受到體內(nèi)外一些因素的調(diào)節(jié)。Dai等[22,23]研究表明,敲除小鼠圓形精子細(xì)胞中的 GRTH基因可導(dǎo)致 Let-7家族的表達(dá)水平以及Let-7d和Let-7g的前體轉(zhuǎn)錄水平顯著升高; Piskounova等[53]研究表明,敲除Lin-28基因可促進(jìn)Let-7的成熟體形成,從而證明Lin-28蛋白可以直接或間接在轉(zhuǎn)錄水平對Let-7進(jìn)行負(fù)調(diào)控。此外,也有研究表明,Let-7家族(a,d,e,f,g)能夠調(diào)控精子生成過程中PGCs增殖和發(fā)育,Let-7家族(7,a,b,c,d,e)能夠調(diào)控精原干細(xì)胞和精原細(xì)胞的分化和增殖[32,41]。由此可見,Let-7家族成員在睪丸發(fā)育和精子生成過程中均表現(xiàn)出明顯的調(diào)控作用,而且其自身的表達(dá)也受到體內(nèi)外一些因素的調(diào)控。

5 展 望

睪丸的正常發(fā)育和生精對保障種群延續(xù)和充分利用優(yōu)良種公畜的精液具有十分重要的作用,而miRNA在睪丸組織發(fā)育和精子生成的各個(gè)階段均發(fā)揮著重要的作用,但是這方面的研究卻還處于初步階段。因此,研究miRNA對正常睪丸發(fā)育和精子生成的調(diào)控作用的意義重大,不僅為研究人類和種公畜的生殖疾病的理論基礎(chǔ)做出了很好的補(bǔ)充,還為改善畜牧生產(chǎn)中種公畜的精液品質(zhì)提供了一個(gè)新的思路和途徑。

在睪丸miRNA后續(xù)的相關(guān)研究中,應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)開展睪丸發(fā)育和精子生成相關(guān) miRNA的表達(dá)分析和功能驗(yàn)證等方面的研究。對miRNA的表達(dá)譜分析應(yīng)著眼于睪丸發(fā)育和精子生成的不同階段特異性表達(dá)的 miRNA,探討睪丸發(fā)育和精子生成過程中的miRNA與精液品質(zhì)的相關(guān)性,篩選 miRNA的分子標(biāo)記。而對于miRNA的功能驗(yàn)證,則應(yīng)深入研究功能性miRNA的作用機(jī)理和睪丸miRNA的表達(dá)受到外界因素(環(huán)境因素、營養(yǎng)因素等)調(diào)控的機(jī)制以及怎樣利用miRNA來調(diào)控種公畜睪丸健康和精液品質(zhì)。應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞水平和動(dòng)物機(jī)體水平的試驗(yàn)驗(yàn)證有機(jī)地結(jié)合在 miRNA的研究中,探究抑制和過表達(dá)miRNA對睪丸發(fā)育和精子生成的影響?？梢灶A(yù)見,對于種公畜而言,探明miRNA與其靶基因的關(guān)系和miRNA調(diào)控精子生成及精液品質(zhì)的潛在機(jī)理,可為在畜牧生產(chǎn)中獲得品質(zhì)優(yōu)良的精液和分子育種提供新的理論依據(jù),與此同時(shí)也為治療雄性不育、睪丸癌等各種睪丸疾病提供新的思路。

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