黃海城，劉 歡，安 靚

（1.南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州 510515；2.深圳華大基因研究院，深圳 518083）

上皮組織特異性表達(dá)N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬胚胎成纖維細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定

黃海城1，劉 歡2，安 靚1

（1.南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣州 510515；2.深圳華大基因研究院，深圳 518083）

目的構(gòu)建上皮組織特異性表達(dá)鼻咽癌來(lái)源潛伏膜蛋白1（N-LMP1）和人補(bǔ)體受體2（CR2）真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞并篩選整合有N-LMP1和CR2基因的細(xì)胞克隆，為構(gòu)建與EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型奠定基礎(chǔ)。方法通過(guò)直接合成ED-L2啟動(dòng)子和N-LMP1，從人B淋巴細(xì)胞中的RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出CR2，將上述3個(gè)片段逐個(gè)連接到真核表達(dá)載體pN1上，構(gòu)建上皮組織特異性表達(dá)N-LMP1和CR2的載體pN1-EDL2-N-LMP1-CR2；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)藥物G418篩選和PCR鑒定陽(yáng)性克隆。結(jié)果成功構(gòu)建上皮組織特異性表達(dá)N-LMP1和CR2的真核表達(dá)載體pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2，并成功整合到豬胚胎成纖維細(xì)胞的基因組中，獲得了整合有目的基因N-LMP1和CR2的豬胚胎成纖維細(xì)胞克隆。結(jié)論獲得了上皮組織特異性表達(dá)N-LMP1和CR2的豬胚胎成纖維細(xì)胞克隆，為通過(guò)細(xì)胞核移植方法獲得表達(dá)N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬提供了供體細(xì)胞。

N-LMP1；CR2；豬胚胎成纖維細(xì)胞；鼻咽癌

鼻咽癌是中國(guó)最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤之一，發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，具有明顯的地域性。在其多因素的發(fā)展過(guò)程中，遺傳易感性、EB病毒和環(huán)境因素被認(rèn)為是主要原因。EBV是如何進(jìn)入鼻咽部上皮細(xì)胞從而引發(fā)鼻咽癌的，至今仍未定論，但B淋巴細(xì)胞膜上的EB病毒受體己經(jīng)明確為CR2［1-3］，有關(guān)上皮細(xì)胞是否表達(dá)CR2至今仍有爭(zhēng)論，但己有多位研究者嘗試用不同的方法將CR2基因?qū)攵喾N細(xì)胞，所有研究均證實(shí)，在提高細(xì)胞內(nèi)CR2表達(dá)水平后，EBV可成功感染原不能感染的細(xì)胞，或能明顯提高細(xì)胞對(duì)EBV的感染率［4-7］。LMP1基因是EB病毒最可能的瘤基因，在鼻咽癌組織中獲得的LMP1（N-LMP1）基因不僅在DNA序列上與標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)株B95-8來(lái)源的LMP1（B-LMP1）存在明顯差異，而且在功能上與后者也不盡一致，特別是N-LMP1的致瘤能力明顯強(qiáng)于B-LMP1［8-10］。因此構(gòu)建EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型時(shí)，用N-LMP1就更具有針對(duì)性。選用特異性啟動(dòng)子ED-L2構(gòu)建組織特異性表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為一種較成熟的手段。Nakagawa，H.［3，11］曾利用ED-L2啟動(dòng)子指導(dǎo)目的瘤基因CyclinD1在轉(zhuǎn)基因鼠舌頭、食道、前胃和皮膚組織特異性表達(dá)。藍(lán)柯曾用ED-L2啟動(dòng)子調(diào)節(jié)鼻咽癌來(lái)源的LMP1建立轉(zhuǎn)基因小鼠，并觀察到LMP1基因在F0代小鼠鼻咽部出現(xiàn)了不典型增生病變［3，12］。從ED-L2的表達(dá)特性來(lái)看，它具有嗜上皮性，而且在鼻咽上皮的表達(dá)活性較高，因此，如果利用ED-L2構(gòu)建轉(zhuǎn)基因，可望使目標(biāo)基因在鼻咽上皮高水平表達(dá)。

豬在解剖、組織、生理和營(yíng)養(yǎng)代謝、血液生化指標(biāo)、疾病發(fā)生過(guò)程等方面與人類(lèi)極為相近［13］，豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一個(gè)重要應(yīng)用是建立人類(lèi)疾病模型，近年來(lái)，體細(xì)胞基因修飾技術(shù)、體細(xì)胞核移植技術(shù)的發(fā)展使得對(duì)豬等大動(dòng)物進(jìn)行高效的基因操作成為可能［14，15］。應(yīng)用該技術(shù)只需要對(duì)豬的體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，而后通過(guò)體細(xì)胞核移植即可獲得可穩(wěn)定遺傳的基因修飾豬，此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展推進(jìn)了豬作為人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的研究。運(yùn)用該技術(shù)，豬作為人類(lèi)疾病動(dòng)物模型已應(yīng)用在糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及人類(lèi)異種器官移植等方面［16-20］，但在有關(guān)鼻咽癌方面尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了整合了N-LMP1和CR2基因的豬胚胎成纖維細(xì)胞，為制備鼻咽部高表達(dá)N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬提供前提條件，為今后構(gòu)建與EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞

E.coli DH5α、質(zhì)粒pN1、第一個(gè)黃種人基因組測(cè)序所使用的炎黃細(xì)胞［21］（感染EB病毒后永生化的人淋巴細(xì)胞）和豬胚胎成纖維細(xì)胞均由華大基因研究院動(dòng)物基因工程實(shí)驗(yàn)室提供，質(zhì)粒pGH-ED-L2和pGH-N-LMP1均由上海捷瑞生物工程有限公司合成

1.2 工具酶與主要試劑

各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)于New England Biolabs，2*Taq Plus PCR Master Mixture、pMD?18-T Vector、第一鏈cDNA合成試劑盒均購(gòu)自TaKaRa（大連）公司，基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自TIANGEN（北京）公司，Lipofectamine 2000來(lái)自Invitrogen（美國(guó)）公司，胎牛血清、高糖DMEM、G418、谷氨酰胺和非必須氨基酸均購(gòu)自Gibco（美國(guó)）公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.4 各元件PCR產(chǎn)物的獲得與克隆

1.4.1 ED-L2啟動(dòng)子的獲得：以質(zhì)粒pGH-ED-L2為模板，表1中ED-L2-F和ED-L2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。將所獲得的ED-L2片段與pMD18-T Simple載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建ED-L2的克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由華大基因測(cè)序。

1.4.2 N-LMP1基因的獲得：以質(zhì)粒pGH-N-LMP1為模板，表1中N-LMP1-F和N-LMP1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。將所獲得的N-LMP1片段與pMD18-T Simple載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建N-LMP1的克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由華大基因測(cè)序。

1.4.3 CR2基因的獲得：培養(yǎng)炎黃細(xì)胞后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，按照第一鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。以第一鏈cDNA為模板，表1中CR2-F和CR2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。將所獲得的CR2片段與pMD18-T Simple載體連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建CR2的克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后由華大基因測(cè)序。

1.5 N-LMP1和CR2上皮組織特異表達(dá)載體的構(gòu)建

用SmaⅠ和Age I雙酶切CR2基因回收產(chǎn)物，與同樣酶切處理的pN1載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pN1-CR2重組質(zhì)粒；用Bgl II和Sal I雙酶切N-LMP1基因回收產(chǎn)物，與同樣酶切處理的pN1-CR2載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pN1-N-LMP1-CR2重組質(zhì)粒；用Ase I和Bgl II雙酶切ED-L2啟動(dòng)子回收產(chǎn)物，與同樣酶切處理的pN1-N-LMP1-CR2載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)，卡那青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆后提取質(zhì)粒，獲得表達(dá)載體pN1-ED-L2-NLMP1-CR2，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定。

1.6 轉(zhuǎn)染

將豬胚胎成纖維細(xì)胞接種于12孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85％～90％融合度時(shí)棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。在微量離心管中準(zhǔn)備溶液A、B。A液：1μg質(zhì)粒+50μL無(wú)血清培養(yǎng)基；B液：5μL Lipofectamine 2000+50μL無(wú)血清培養(yǎng)基。A、B兩液室溫孵育5min后溫和混合，室溫放置20min，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，再用15％胎牛血清-DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至1mL，將培養(yǎng)皿放入38℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程不加雙抗。

1.7 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定

轉(zhuǎn)染72h后，在含有G418（500mg/mL）的選擇培養(yǎng)基中加壓篩選8d，獲得具有抗生素抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)。取少量細(xì)胞提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)凍存，留作核移植供體細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1ED-L2、N-LMP1和CR2的擴(kuò)增

圖1 ED-L2、N-LMP1和CR2的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of ED-L2，N-LMP1 and CR2

通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得794bp的ED-L2序列和1 290bp的N-LMP1序列（圖1），獲得的DNA片段，大小與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)測(cè)序鑒定正確。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增，獲得3 115bp的CR2片段（圖1），經(jīng)測(cè)序鑒定與GenBank中序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果一致。

圖2 重組質(zhì)粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2

2.2 上皮組織特異性表達(dá)N-LMP1和CR2的表達(dá)載體pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的構(gòu)建：構(gòu)建的載體以ED-L2為啟動(dòng)子，N1自帶的SV40polyA為終止信號(hào)，Neomycin是G418篩選標(biāo)記。見(jiàn)圖2。

2.2.2 pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2載體的酶切鑒定結(jié)果：重組質(zhì)粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2經(jīng)Ase I和Sal I雙酶切后理論上可切出7 218bp的片段和2 071bp的片段，經(jīng)Ase I單酶切為9.3kb的片段，電泳圖片符合理論要求，且測(cè)序與預(yù)期序列完全一致，載體構(gòu)建成功。見(jiàn)圖3。

2.3 陽(yáng)性克隆的鑒定

在含有G418的選擇培養(yǎng)基中篩選8d，獲得具有抗生素抗性的陽(yáng)性細(xì)胞克隆，提取細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增出N-LMP1基因（1 290bp）和CR2基因（3 115bp）片段，說(shuō)明所得到的陽(yáng)性細(xì)胞的基因組已經(jīng)插入了目的片段。見(jiàn)圖4。

圖3 重組質(zhì)粒pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2的酶切鑒定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2 by enzyme digestion

3 討論

LMP1基因是EB病毒最可能的瘤基因，在EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系這一研究領(lǐng)域中，LMP1的研究是一大熱點(diǎn)。LMP1是一跨膜蛋白，標(biāo)準(zhǔn)株EBV來(lái)源的LMP1（B-LMP1）含有386個(gè)氨基酸，它由一個(gè)短的N端胞內(nèi)區(qū)，跨膜區(qū)及一個(gè)長(zhǎng)的C端胞內(nèi)區(qū)組成。NPC來(lái)源的LMP1基因（N-LMP1）由Hu等克隆，來(lái)自中國(guó)鼻咽癌患者，它的DNA序列與標(biāo)準(zhǔn)株LMP1存在明顯差異，最明顯的差異在于它的第三外顯子有一個(gè)30bp堿基的缺失和3個(gè)33bp重復(fù)序列的插入，從而導(dǎo)致它編碼404個(gè)氨基酸［8］。研究表明，N-LMP1在生物學(xué)功能上與標(biāo)準(zhǔn)株LMP1至少存在如下不同點(diǎn)［3，9，10，22，24］：1、N-LMP1比BLMP1致瘤性強(qiáng)；2、N-LMP1活化NFkB的能力比BLMP1強(qiáng)；3、N-LMP1的免疫原性比B-LMP1低；4、N-LMP1比B-LMP1能更大程度上調(diào)EGFR的表達(dá)。CR2是一個(gè)分子量為145kD的單鏈糖蛋白，N端在細(xì)胞外，含20個(gè)氨基酸的疏水信號(hào)膚及1005個(gè)氨基酸的膜外區(qū)，接著是24個(gè)氨基酸的疏水跨膜區(qū)，C端由34個(gè)氨基酸構(gòu)成胞漿尾，屬單一跨膜蛋白受體。CR2原為補(bǔ)體C3d的配體，后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，EBV主要?dú)つぬ堑鞍譯p350/220分子中含有與C3d分子受體結(jié)合區(qū)核心序列EDPGKQLYNVEA高度同源的序列EDPGFENVEI，因而EBV同樣可與CR2分子結(jié)合［25］。為了能在鼻咽部上皮組織細(xì)胞里同時(shí)表達(dá)N-LMP1和CR2這兩種蛋白，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了上皮特異性啟動(dòng)子ED-L2，構(gòu)建了載體pN1-ED-L2-N-LMP1-CR2，N-LMP1和CR2之間含有環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致兩個(gè)目的基因翻譯后不會(huì)形成融合蛋白。本研究所構(gòu)建的載體經(jīng)酶切與測(cè)序鑒定正確，將載體轉(zhuǎn)入豬胚胎成纖維細(xì)胞，所獲得克隆細(xì)胞經(jīng)PCR鑒定目的基因N-LMP1和CR2，獲得整合了兩個(gè)目的基因的胚胎成纖維細(xì)胞，為以后利用核移植技術(shù)生產(chǎn)鼻咽部上皮表達(dá)N-LMP1和CR2轉(zhuǎn)基因豬提供了供體細(xì)胞，為今后構(gòu)建與EBV感染相關(guān)的豬鼻咽癌模型奠定了基礎(chǔ)。

圖4 陽(yáng)性克隆的鑒定A：PCR products of the N-LMP1 gene；M：DNA marker（1kp）；Lane 1：Positive control；Lane 2-3：Clone cells；Lane 4：Negative control；B：PCR products of the CR2 gene；M：DNA marker（1kp）；Lane 1：Positive control；Lane 2-3：Clone cells；Lane 4：Negative control.Fig.4 Identification of the positive clone cells

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Construction and identification of transgenic porcine embryonic fibroblasts expressing epithelium-specific N-LMP1 and CR2

HUANG Hai-cheng，LIU Huan，AN Jing
（Cancer Institute，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

ObjectiveTo construct an eukaryotic expression vector and identify the integration of nasopharyngeal carcinoma-derived oncogene latent membrane protein 1（N-LMP1）and CR2 gene in porcine embryonic fibroblasts，and to provide a basis for construction of EBV-infection associated swine nasopharyngeal carcinoma model.MethodsED-L2 and N-LMP1 were synthesized directly.CR2 was amplified by RT-PCR from human B lymphocytes.The three fragments mentioned above were subcloned one by one into the eukaryotic expression vector pN1，and then the vector was transfected into porcine embryonic fibroblasts using the liposome reagent，according to the manufacturer's protocol.The cells were selected with G418 antibiotic and identified by PCR amplification.ResultsN-LMP1 and CR2 epithelium-specific expression vector was successfully constructed and integrated into the genome of the porcine fibroblasts，and clone cells integrating the N-LMP1 and the CR2 genes were obtained.ConclusionsThe porcine fibroblast clones integrating N-LMP1 and CR2 are obtained and they should be of great value for the construction of N-LMP1 and CR2 transgenic swine via cellnuclear transfer.

N-LMP1；CR2；Porcine embryonic fibroblasts；Nasopharyngeal carcinoma

R33

A

1671-7856（2014）02-0001-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.001

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（K1010524）。

黃海城（1989-），男，碩士研究生，主要從事腫瘤基礎(chǔ)研究，E-mail：haicheng891@qq.com。

安靚（1959-），女，教授，主要從事干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的分化研究及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究，E-mail：anjing77@163.com。

2013-11-19