李江超，周澤啟，葉 杰，韓 露，葉宇翔，劉 影，何曉東，陳 卉，袁俏冰，黎 帥，張靜麗，王麗京

（廣東藥學院 血管生物學研究所，廣東 廣州 510006）

PSGL-1基因敲除小鼠血中MIP-1γ和TNF-α的表達

李江超，周澤啟，葉 杰，韓 露，葉宇翔，劉 影，何曉東，陳 卉，袁俏冰，黎 帥，張靜麗，王麗京

（廣東藥學院 血管生物學研究所，廣東 廣州 510006）

目的研究PSGL-1缺失對遺傳基因工程小鼠外周血血常規(guī)的影響，并檢測外周血中炎癥因子IGFBP-6、TNF-α和MIP-1γmRNA表達水平。方法用血常規(guī)檢測方法檢測正常C57/BL/6小鼠和PSGL-1基因缺失的基因工程小鼠（PSGL-1-/-小鼠）的外周血中血常規(guī)的差異；其次，提取兩種鼠的血液的mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用real-time PCR方法，檢測C57小鼠與PSGL-1-/-小鼠外周血中炎癥因子TNF-α和MIP-1γmRNA的差異。結(jié)果與對照組C57小鼠相比，PSGL-1-/-基因工程小鼠在12周齡時外周血中中性粒細胞（*P＜0.05）、淋巴細胞（＊＊P＜0.01）和白細胞細胞（＊＊＊P＜0.001）總數(shù)顯著增加炎癥因子TNF-α以及MIP-1γ表達增加（P＜0.05）。結(jié)論PSGL-1的缺失改變了小鼠細胞因子并影響了外周血的血細胞組成，MIP-1γ和TNF-α炎癥因子上調(diào)，有可能影響了小鼠的免疫功能。

PSGL-1；TNF-α；MIP-1γ，基因工程動物

P-選凝素糖蛋白配體1（P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）是20世紀90年代初期發(fā)現(xiàn)的一種黏附分子，具有同源二聚體結(jié)構(gòu)的跨膜糖蛋白，表達于白細胞的膜表面。PSGL-1是P-選凝素的配體，同時也是L-選凝素和E-選凝素的配體，研究表明其在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。在炎癥環(huán)境中，PSGL-1與P-選凝素的相互作用在白細胞黏附的起始階段發(fā)揮重要作用，促進白細胞與內(nèi)皮細胞的緊密連接和穿越血管壁到炎癥部位［1］。PSGL-1在介導白細胞黏附的同時，也可以作為信號分子轉(zhuǎn)導胞外信號，促進白細胞活化并使其穩(wěn)定黏附［2］。另外研究表明PSGL-1對T細胞歸巢有著顯著影響，從而影響T細胞的發(fā)育［3］。而最近的報道，PSGL-1表達在轉(zhuǎn)移的前列腺癌細胞上，所以其分子機制和功能有待進一步研究［4］。

遺傳基因工程小鼠模型是生命科學研究手段中具人類疾病模擬性的實驗模型之一，小鼠是哺乳類實驗動物，具有體型小，繁殖力強，飼養(yǎng)成本低，能較好模擬人體等多種優(yōu)點，所以我們采用PSGL-1敲除的基因工程小鼠，在動物水平驗證了PSGL-1對免疫功能得影響，比細胞水平有著顯著優(yōu)勢。因為細胞水平無法模擬免疫學的改變。利用基因工程小鼠建立各種腫瘤模型是當今腫瘤學研究的新趨勢?；蚯贸∈竽Ｐ驮谀[瘤學研究上具有其它模型無法比擬的優(yōu)勢：在不伴有藥物副作用的條件下，基因產(chǎn)物的作用被完全消除［5-6］。

在本研究中，為了進一步了解PSGL-1的作用和功能，我們采用PSGL-1基因工程敲除小鼠，進一步在動物體內(nèi)了解PSGL-1缺失后對免疫細胞和炎癥因子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSGL-1敲除后，小鼠的血常規(guī)發(fā)生改變，重要的炎癥因子TNF-α和趨化因子MIP-1γ顯著上升。這些實驗結(jié)果為進一步研究PSGL-1如何在機體內(nèi)介導炎癥從而發(fā)揮作用有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

PSGL-1-/-小鼠（B6.Cg-Selplgtm1Fur/J）購買自美國Jackson實驗室，SPF環(huán)境中飼養(yǎng)擴群。蛋白酶K及dNTP等PCR體系為Sigma公司產(chǎn)品，Trizol購自Invitrogen，PCR引物由Invitrogen公司合成，Taq酶、Tris飽和酚及氯仿、異丙醇為廣州康龍公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 建系及擴群：PSGL-1+/-與同籠PSGL-1+/-小鼠雜交，得到的子代有三種情況PSGL-1+/-、PSGL-1+/+、PSGL-1-/-，經(jīng)鑒定后得到PSGL-1-/-即目的實驗的小鼠，PSGL-1+/+即為正常小鼠（C57小鼠），作為對照，PSGL-1+/-用來繁殖和配種。

1.2.2 PSGL-1-/-基因工程小鼠鑒定：PSGL-1-/-小鼠鑒定引物序列為：野生型：P1：5'-AGC TTC CTT GTG CTG CTG AC-3'：P2：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'，擴增條帶為140bp；PSGL-1基因突變型：P1：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'：P2：5-'CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG-3'，擴增條帶為500bp。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃/30s、65℃/1min、72℃/1min，35個循環(huán)；72℃延伸2min。用1％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果，紫外燈下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.3 外周血血常規(guī)的檢測：取同批周齡大小的C57、PSGL-1-/-小鼠（11周，雌雄比例均衡），每組4只，眼眶取血，檢測外周血中變化情況，采用臨床血常規(guī)儀器計數(shù)各類細胞的百分比和絕對值。

1.2.4 熒光定量PCR：對上述分組小鼠，眼眶取血法取C57、PSGL-1-/-，500μL血中加入1mL Trizol，12 000r/min，4℃離心10min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5min，使之充分裂解；加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，然后放置3min；13 400r/min，4℃離心15min，離完后分為3層，取最上層（中間一層為蛋白）至一新的EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒數(shù)次，室溫沉淀10min；13 400r/min，4℃離心10min，棄上清液；加入75％乙醇（DEPC水溶解），顛倒數(shù)次混勻；8 300r/min，4℃5min，棄上清液，小心吸盡液體（此時可以看到白色沉淀即為RNA）；RNA略干后加入20μL DEPC水。用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用得到cDNA進行real-time PCR，（Tiangen kit貨號FP205）95℃預變性15min，94℃/10min、60℃/32s，反應40個循環(huán)，融解曲線分析引物特異性，Ct值標準化后計算相對拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PSGL-1基因繁殖和鑒定

根據(jù)PCR后電泳條帶結(jié)果，可以區(qū)分出條帶為500bp的為PSGL-1基因突變的小鼠，即PSGL-1-/-小鼠，如圖1第二泳道（從左向右）即是；PCR擴增條帶為500bp和140bp為雜合子PSGL-1+/-，圖1中第一泳道即是，野生型PCR擴增產(chǎn)物條帶為140bp。其中長度約500 bp的條帶為PSGL-1基因突變的小鼠特有的條帶；140bp的條帶為正常小鼠以及PSGL-1基因突變的雜合小鼠都應該具有的條帶。

注：Marker：DNA marker 2000。圖1 鑒別PSGL-1缺失的基因小鼠Note：Marker：DNA marker 2000.Fig.1 Identification of the PSGL-1-/-mice

2.2 PSGL-1基因工程小鼠中外周血常規(guī)異常

取C57小鼠和PSGL-1-/-小鼠的外周血進行血常規(guī)檢驗，與正常小鼠對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSGL-1-/-外周血中中性粒細胞（P＜0.05）、淋巴細胞（P＜0.01）和白細胞細胞總數(shù)顯著增加（P＜0.001）（圖2），在本實驗中BASO為噬堿細胞絕對值、EO為噬酸細胞絕對值、LYMPH為淋巴細胞絕對值、MONO為單核細胞絕對值、NEUT為分葉細胞（中性粒細胞）絕對值、WBC為白細胞絕對值。嗜酸性細胞和單核細胞數(shù)量的絕對值有差異趨勢，但是沒有統(tǒng)計意義（P＞0.05）（圖2）。

2.3 MIP-1γ和IGFBP-6 mRNA水平顯著上調(diào)

上述結(jié)果提示淋巴細胞等細胞數(shù)量絕對值增加，TNF-α是重要的炎癥因子，而IGFBP-6和MIP-1γ在我們以前的蛋白芯片結(jié)果提示上調(diào)，而這些炎癥因子對淋巴細胞和中性粒細胞以及堿性淋巴細胞調(diào)節(jié)有著重要意義，所以我們對IGFBP-6，MIP-1γ和TNFα mRNA水平進行檢測。提取兩種鼠的血液得到總mRNA，獲得cDNA，進行real-time PCR檢測，結(jié)果如圖所示（圖3）小鼠血液中IGFBP-6、TNF-α、MIP-1γ均以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果顯示TNF-α（P＜0.01）、MIP-1γ升高（P＜0.05）（圖3）。

圖2 PSGL-1基因工程小鼠中外周血中血細胞變化情況Fig.2 Changes of blood cell counts in peripheral blood of the PSGL-1 knockout mice

圖3 相關(guān)炎癥細胞因子的檢測Fig.3 The relative expression of cytokine factors in peripheral blood

3 討論

PSGL-1主要表達在白細胞上，其配基是 P-selectin、L-selection及E-selection，它是一種I型跨膜糖蛋白［7］。介導白細胞在內(nèi)皮上粘附、聚集及活化并釋放炎癥遞質(zhì)，參與炎癥過程，也存在白細胞粘附、活化的反饋機制［8-10］。靜息的血小板和內(nèi)皮細胞很少表達P-選擇素，在凝血酶、組胺、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interferon-1β，IL-1β）、脂多糖（lipopolysacchride，LPS）、氧自由基、補體C5a、高血糖等剌激下，發(fā)生脫顆粒反應，顆粒膜與細胞膜迅速融合，可使已儲存的P-選擇素于數(shù)分鐘內(nèi)在細胞表面表達，從而介導白細胞的俘獲，順血流方向沿內(nèi)皮細胞表面向損傷部位滾動，這是白細胞牢固粘附和移行外滲的最初亦是最關(guān)鍵的階段。另外，PSGL-1還可能與胸腺的內(nèi)皮細胞結(jié)合，影響T細胞的定位和T細胞在胸腺內(nèi)的發(fā)育。最近的報道，一些白血病腫瘤細胞表達PSGL-1，而且最近報道PSGL-1表達在腫瘤細胞有助于前列腺癌的轉(zhuǎn)移。

我們的研究提示PSGL-1缺失后，影響了外周血的改變，淋巴細胞和中性粒細胞等增加，我們推測可能PSGL-1影響了白細胞的發(fā)育或者影響了白細胞的遷移，其不能趨化到其他器官，導致血液中白細胞增加，另外，我們還檢測到CD3下調(diào)（未展示），而外周血中總淋巴細胞是顯著升高的，淋巴細胞還包括NK細胞，B淋巴細胞等，另外，血常規(guī)儀原理是根據(jù)血細胞非傳導的性質(zhì)和引起的電阻變化進行檢測為基礎(chǔ)所進行血細胞計數(shù)和體積測定。而流式細胞的檢測原理基于正電或負電的液滴通過高壓偏轉(zhuǎn)板時發(fā)生向陰極或向陽極的偏轉(zhuǎn)，從而達到了分類收集細胞的目的。

進一步的mRNA水平檢測，也證實PSGL-1缺失的基因工程小鼠中MIP-1γ的變化和TNFα表達發(fā)生改變，而NCBI生物信息學提示MIP-1γ主要表達在髓細胞和單核細胞，從外周血中的變化（圖2）也證實了PSGL-1可能影響了髓細胞的分化或其它信號通路，大量研究的證明PSGL-1影響了炎癥的發(fā)生和免疫的穩(wěn)態(tài)調(diào)控［1］。但是PSGL-1如何影響MIP-1γ的變化還不是很清楚，需要我們更進一步的探索。

腫瘤壞死因子-α最初發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤的生長以及可以誘導小鼠內(nèi)皮細胞P選凝素的表達，是一種涉及到系統(tǒng)性炎癥的細胞因子。主要由巨噬細胞分泌，其它類型的細胞也能產(chǎn)生。腫瘤壞死因子α的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細胞的功能。作為一種內(nèi)源性致熱原，它能夠促使發(fā)熱，引起細胞凋亡，通過誘導產(chǎn)生IL-1和IL-6，引發(fā)炎癥，或阻止腫瘤發(fā)生和病毒復制。但是，當機體中TNF-α超過一定量時，TNF-α與其他多種炎性因子一起，反而能促進癌癥的發(fā)生發(fā)展及產(chǎn)生多種病理性損傷［11-14］。而本研究結(jié)果證實PSGL-1的缺失會使TNF-α升高，文獻報道，Wnt途徑參與白細胞在炎癥中的反應，如調(diào)節(jié)單核細胞向內(nèi)皮細胞的遷移作用［15］。上述結(jié)果提示PSGL-1的缺失可能與炎癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)系。

綜上所述，PSGL-1作為白細胞上的膜蛋白，參與白細胞的活化、胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導，從而參與了炎癥的形成和發(fā)展。我們以前發(fā)現(xiàn)PSGL-1缺失的腸道腫瘤惡化加劇，其PSGL-1通過炎癥促進腫瘤發(fā)展的機制有待深入研究。

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Expression of MIP-1γ and TNF-α in PSGL-1 knockout mice

LI Jiang-chao，ZHOU Ze-qi，YE Jie，HAN Lu，YE Yu-xiang，LIU Ying，HE Xiao-dong，CHEN Hui，YUAN Qiao-bing，LI Shuai，ZHANG Jing-li，WANG Li-jing
（Institute of Vascular Biology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

ObjectiveTo investigate the effect of loss of PSGL-1 on routine blood test results in PSGL-1 knockout（PSGL-1-/-）mice，and to detect the expression levels of cytokines IGFBP-6，TNF-α and MIP-1γ mRNA in their peripheral blood.MethodsTo detect the differences in routine blood test results of normal C57/BL/6 mice and PSGL-1-/-mice.To prepare cDNA from isolated blood mRNA，and to analyze the differences in expression of cytokines TNF-α and MIP-1γ mRNA in peripheral blood of the C57 mice（control）and PSGL-1-/-mice by real-time PCR.Results Compared with the C57 control mice，the 12-week old PSGL-1-/-mice showed significantly increased neutrophils（P＜0.05），lymphocytes（P＜0.01）and total leukocyte counts（P＜0.001），and increased expression levels of TNF-α and MIP-1γ mRNA in the peripheral blood（P＜0.05）.ConclusionsOur findings suggest that the loss of PSGL-1 changes the cell counts of peripheral blood in mice.The up-regulation of cytokines MIP-1γ and TNF-α may influence the immune function of the mice.

PSGL-1；TNF-α；MIP-1γ；Transgenic mice；Peripheral blood

王麗京（1962-），女，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學。E-mail：wanglijing62@163.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0070-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.015

國家自然基金（31271455）廣東省醫(yī)學科研基金（A2013312）。

李江超，男，博士。E-mail：lijiangchao@gdpu.edu.cn。

2013-12-11

技術(shù)方法