楊濤濤，肖 穎，奚賽飛，馬毅超，方明筍，壽旗揚(yáng)，潘永明，陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053）

大鼠心肌梗死模型構(gòu)建和評(píng)價(jià)方法的改良

楊濤濤，肖 穎，奚賽飛，馬毅超，方明筍，壽旗揚(yáng)，潘永明，陳民利

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053）

目的優(yōu)化和改良大鼠心肌梗死模型的構(gòu)建和評(píng)價(jià)方法，提高模型的可靠性和穩(wěn)定性。方法取雄性SD大鼠結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型，在模型的構(gòu)建過(guò)程中從麻醉、插氣管、保溫、手術(shù)操作、術(shù)后護(hù)理等環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，并觀(guān)察不同的麻醉方法和術(shù)后時(shí)間對(duì)心肌梗死程度的影響，用不同的染色方式進(jìn)行心肌梗死模型的評(píng)價(jià)。結(jié)果對(duì)比大鼠心肌梗死模型構(gòu)建過(guò)程中各組大鼠麻醉時(shí)間、術(shù)后恢復(fù)以及心肌梗死面積的結(jié)果，戊巴比妥鈉是更合適的麻醉藥；結(jié)扎手術(shù)后時(shí)間對(duì)模型心肌梗死范圍無(wú)明顯影響（P＞0.05），但心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)面積隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)明顯減少（P＜0.01）；TTC與依文思藍(lán)雙重染色相對(duì)TTC染色能明顯觀(guān)察到心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)范圍。結(jié)論優(yōu)化和改進(jìn)后的大鼠心肌梗死模型，提高了動(dòng)物福利，制備和評(píng)價(jià)方法更加客觀(guān)準(zhǔn)確。

大鼠；心肌梗死模型；方法；改良

心肌梗死是一種嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)疾病，已成為中老年人群死亡的主要病因之一。心肌梗死動(dòng)物模型是研究梗死性心臟病病理機(jī)制和相關(guān)治療藥物療效評(píng)價(jià)的一個(gè)重要手段，而心肌梗死面積（myocardial infarct size，MIS）的大小是評(píng)價(jià)梗死程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一［1］。采用手術(shù)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈降支造成大鼠急性心肌梗死是目前公認(rèn)的心肌梗死經(jīng)典動(dòng)物模型［2］，但由于模型制作過(guò)程中受如麻醉、插氣管、保溫、手術(shù)方法和術(shù)后護(hù)理等各個(gè)環(huán)節(jié)影響以及梗死心肌自身的病理生理特點(diǎn)［3］，存在模型制作和術(shù)后動(dòng)物死亡率高，心肌梗死面積個(gè)體差異大等問(wèn)題。本研究在以往的工作基礎(chǔ)上，對(duì)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立急性心肌梗死模型的制作過(guò)程（包括麻醉、插氣管、手術(shù)操作、術(shù)后護(hù)理以及心肌染色等環(huán)節(jié)）進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，并觀(guān)察不同的麻醉方法和術(shù)后時(shí)間對(duì)心肌梗死程度的影響，用不同的染色方式進(jìn)行心肌染色，探討其合理的評(píng)價(jià)方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，體重220g～250g，中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2012-0002］；飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障系統(tǒng)［SYXK（浙）2012-0002］，環(huán)境溫度：（20±2）℃，相對(duì)濕度：50％～60％，光照：（150～200）LX，12h/12h明暗交替，噪間＜50db；并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑

戊巴比妥鈉：25g/瓶，含量≥99.0％，批號(hào)：WS20120112，德國(guó)進(jìn)口分裝，上海西唐科技有限公司；水合氯醛：分析純250g/瓶，批號(hào)：20120315，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠(chǎng)；異氟烷（isoflurane）：100mL/瓶，產(chǎn)品批號(hào)：120203，魯南貝特制藥有限公司；氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）：10g/瓶，批號(hào)：20120905，中國(guó)華東師范大學(xué)化工廠(chǎng)；伊文思藍(lán)（Evans blue）：10g/瓶，批號(hào)：W20110325，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖G-10（regular agarose G-10），100g/瓶，批號(hào)：111935，法國(guó)Biowest公司；青霉素鈉：80萬(wàn)U/瓶，批號(hào)：120422，廣州白云山天心制藥股份有限公司；氯化鉀：分析純AR，500g/瓶，批號(hào)：F20090409，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

Summit小動(dòng)物麻醉呼吸機(jī)，美國(guó)Summit公司；AL204-電子分析天平，瑞士Mettler公司；Gaymar恒溫手術(shù)臺(tái)，美國(guó)HallowelL公司；Model 994超低溫冰箱，Thermo Scientific公司；DK-600型電熱恒溫水槽，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HP-LaserJet M1213nf MFP掃描儀，美國(guó)惠普公司。手術(shù)器械包（手術(shù)剪、頭和直頭止血鉗、彎形鑷子、顯微持針器、開(kāi)胸器、手術(shù)線(xiàn)、干棉花、酒精棉、紗布、頭皮針、注射器、三通管、棉線(xiàn)），6-0無(wú)菌醫(yī)用非吸收性縫合線(xiàn)無(wú)損傷縫合針，杭州富陽(yáng)醫(yī)用縫合針線(xiàn)廠(chǎng)。

1.4 方法

1.4.1 手術(shù)方法：雄性SD大鼠麻醉、手術(shù)區(qū)剃毛后，固定在45°～60°斜臺(tái)，將上切牙固定在鼠板邊緣，光源照亮頸喉部有利于顯露聲門(mén)，行無(wú)創(chuàng)經(jīng)口直視氣管插管，口腔鏡有霧氣檢查插管成功；待大鼠呼吸平穩(wěn)后轉(zhuǎn)移至恒溫手術(shù)臺(tái)（36～38）℃，仰臥位固定在鼠板上，手術(shù)區(qū)擦聚維酮碘消毒，連接呼吸機(jī)，呼吸比2：1，潮氣量30mL/kg，呼吸頻率60～65次/min，大頭針穿刺左右前肢皮下，連接心電圖機(jī)測(cè)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。大鼠呼吸平穩(wěn)后，沿左胸骨2mm處切開(kāi)皮膚約（2～2.5）cm，第三、四肋骨間隙鈍性分離肋間肌，開(kāi)胸器撐開(kāi)肋間隙擴(kuò)大手術(shù)視野。小心地撕開(kāi)心包膜暴露心臟，消毒棉輕輕固定好，于左心耳下緣2mm～3mm處用6-0無(wú)創(chuàng)縫合針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針深度約2mm，結(jié)扎跨度（2～3）mm，做兩次外科手術(shù)結(jié)扎打結(jié)。結(jié)扎后肉眼可見(jiàn)結(jié)扎局部和左心室前壁呈灰白至紫紺，或Ⅱ?qū)?lián)心電圖S-T段抬高并持續(xù)15min以上則為心肌梗死結(jié)扎成功標(biāo)志。結(jié)扎后逐層縫合胸腔，并預(yù)留留置針以防止發(fā)生氣胸，抽胸腔負(fù)壓（抽取時(shí)注意避免留置針針頭吸住腔壁），排除胸腔內(nèi)空氣，恢復(fù)自主呼吸。待大鼠呼吸穩(wěn)定后，放入恢復(fù)籠內(nèi)飼養(yǎng)（房間溫度24℃～26℃），腹腔注射5mL生理鹽水補(bǔ)液后，觀(guān)察并及時(shí)清除氣管痰液；待大鼠蘇醒后肌內(nèi)注射0.5mL（8×104）U青霉素鈉以防感染，次日轉(zhuǎn)移至術(shù)后飼養(yǎng)室進(jìn)行正常飼養(yǎng)。

1.4.2 大鼠分組：雄性SD大鼠80只適應(yīng)飼養(yǎng)后隨機(jī)分為8組：不同麻醉藥物試驗(yàn)30只，即：戊巴比妥鈉、水合氯醛、異氟烷每組各10只；兩種染色方法試驗(yàn)20只，即TTC染色、TTC與依文思藍(lán)雙重染色各10只；術(shù)后造模時(shí)間試驗(yàn)30只，即造模后1d、3d和7d組各10只。

1.4.3 麻醉方法：（1）藥物麻醉：實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食2h以上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室常用麻醉劑量腹腔注射麻醉大鼠：戊巴比妥鈉（45mg/kg）和水合氯醛（300mg/kg）。記錄大鼠麻醉誘導(dǎo)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間。偽手術(shù)組大鼠也采用戊巴比妥鈉麻醉（麻醉誘導(dǎo)時(shí)間是指從注射開(kāi)始到動(dòng)物進(jìn)入麻醉狀態(tài)，麻醉持續(xù)時(shí)間是指進(jìn)入麻醉狀態(tài)至術(shù)后蘇醒；以有無(wú)翻正反射作為大鼠麻醉與否的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)）。（2）氣體麻醉：實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食2h以上，放進(jìn)呼吸機(jī)麻醉盒內(nèi)通入1.5％異氟烷混合氧呼吸麻醉，手術(shù)全程以1％異氟烷混合氧持續(xù)麻醉。記錄大鼠麻醉誘導(dǎo)時(shí)間和停止1％異氟烷混合氧通入后的麻醉持續(xù)時(shí)間。

1.4.4 染色方法：（1）TTC染色：大鼠用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔麻醉后，迅速取下心臟用生理鹽水沖洗除去血污，用濾紙吸干后稱(chēng)取全心重（whole heart，WH），剔除右心室、心房心肌組織，濾紙吸干，稱(chēng)取左心室重量（left ventricle，LV）。然后放入-20℃冰箱中冷凍20min，切片，垂直于心臟長(zhǎng)軸將心室部分每隔2mm橫斷切成5片，置入1％TTC溶液中，37℃避光孵育15min，染色過(guò)程不時(shí)搖動(dòng)使染色液與心肌片充分接觸（TTC溶液用pH 7.4～7.8的磷酸緩沖液配制），染色完成后立即沖洗去多余的染料。TTC染為紅色的為心肌非梗死區(qū)（non-infarct size，NIS），灰白色為梗死區(qū)（infarct size，IS）。掃描拍照，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析心肌梗死面積。梗死區(qū)面積為梗死區(qū)（IS）占左心室重量（LV）或全心重量（WH）之比。（2）TTC與伊文思藍(lán)雙重染色：大鼠用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉后氣管插管接呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔小心地往右心室注入5％伊文思藍(lán)（Evans blue）染液2mL，觀(guān)察2min，待大鼠鞏膜染藍(lán)后，立即向右心室注入10％KCl溶液使心臟停止跳動(dòng)，迅速取下心臟，用濾紙吸干后稱(chēng)取全心重，然后立即置入2％瓊脂糖PBS緩沖液中，約2min后取出，剔除右心室、心房心肌組織，濾紙吸干，稱(chēng)取左心室重量（LV）。然后放入-20℃冰箱中冷凍20min，切片，垂直于心臟長(zhǎng)軸將心室部分每隔2mm橫斷切成5片，置入1％TTC溶液中，37℃避光孵育15min。染色過(guò)程不時(shí)搖動(dòng)使染色液與心肌片充分接觸（TTC溶液用pH 7.4～7.8的磷酸緩沖液配制），染色完成后立即沖洗去多余的染料。伊文思藍(lán)染為藍(lán)色為正常區(qū)（normal area，NA），TTC染為紅色的是缺血仍存活組織，成為危險(xiǎn)區(qū)（area-at-risk，AAR），灰白色為梗死區(qū)（infarct size，IS）。掃描拍照，用Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析心肌缺血區(qū)和梗死區(qū)面積。缺血區(qū)面積為危險(xiǎn)區(qū)（AAR）占左心室重量（LV）或全心重量（WH）之比，梗死面積為梗死區(qū)（IS）占左心室重量（LV）或全心重量（WH）之比。

1.4.5 造模后時(shí)間：SD大鼠用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）麻醉后，行心肌梗死造模手術(shù)，次日將術(shù)后存活的大鼠隨機(jī)分為1d（即次日）、3d和7d組：即分別在造模后1d、3d和7d按方法取樣操作，TTC與伊文思藍(lán)雙重染色法心肌染色，掃描心肌片并統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析心肌組織各區(qū)域的面積，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢驗(yàn)方法采用Oneway ANOVA分析和T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 麻醉效果

由表1可見(jiàn)，不同的麻醉藥的誘導(dǎo)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間各有差異，異氟烷組為大鼠連續(xù)吸入麻醉，麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，停止吸入后麻醉的持續(xù)時(shí)間較短；水合氯醛組與戊巴比妥鈉組為一次性腹腔注射麻醉；水合氯醛組大鼠麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較短，而持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。模型建立的手術(shù)操作和術(shù)后護(hù)理至次日，異氟烷組大鼠全部存活，水合氯醛組術(shù)后至次日死亡3只，戊巴比妥鈉組大鼠死亡1只。

表1 不同麻醉的效果（±s）Tab.1 The effect of different anesthesia（±s）

表1 不同麻醉的效果（±s）Tab.1 The effect of different anesthesia（±s）

注：異氟烷組大鼠放在麻醉盒內(nèi)通1.5％異氟烷混合氧吸入麻醉，且手術(shù)全程以1％異氟烷混合氧持續(xù)麻醉。Note：The rats of isoflurane group were placed inside the anesthesia box with 1.5％isoflurane and oxygen mixed inhalation，and 1％isoflurane and oxygen was used during the whole operation.

組別Groups 劑量Dose方法Method數(shù)量Number誘導(dǎo)時(shí)間（s） Induction time持續(xù)時(shí)間（min） Duration time次日存活Next day survival戊巴比妥鈉組Sodium pentobarbital 45mg/Kg 腹腔注射Intraperitoneal injection 10 183±26 143±37 9水合氯醛組Chloral hydrate 300mg/Kg 腹腔注射Intraperitoneal injection 10 101±18 240±53 7異氟烷組Isoflurane 1.5％ 吸入Inhalation 10 254±35 26±8 10

2.2 不同麻醉方法對(duì)梗死面積的影響

心肌掃描圖與Image J軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，各組可見(jiàn)明顯的心肌梗死區(qū)；水合氯醛組與戊巴比妥鈉組大鼠心肌梗死范圍都明顯高于異氟烷組（P＜0.01），水合氯醛組高于戊巴比妥鈉組。見(jiàn)圖1、圖2。圖1見(jiàn)彩插4。

2.3 不同染色方法的心肌染色效果

由心肌掃描圖可見(jiàn)，TTC染色組心肌片能觀(guān)察到2種顏色區(qū)域：紅色區(qū)域（心肌非梗死區(qū)）和灰白色區(qū)域（心肌梗死區(qū)），而TTC與伊文思藍(lán)雙重染色組能清晰觀(guān)察到3種顏色區(qū)域：藍(lán)色區(qū)域（正常心肌區(qū)）、灰白色區(qū)域（梗死區(qū)）和紅色區(qū)域（缺血仍存活組織，危險(xiǎn)區(qū)），各區(qū)域顏色對(duì)比觀(guān)察明顯。見(jiàn)圖3、圖4。圖3見(jiàn)彩插4。

2.4 造模后不同時(shí)間對(duì)梗死面積的影響

造模后，次日存活的大鼠沒(méi)有出現(xiàn)死亡的情況，精神狀態(tài)尚可，飲食排泄正常。造模后1d、3d、7d組，各組大鼠心肌梗死區(qū)面積差異不大，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)有增加趨勢(shì)，但無(wú)明顯差異（P＞0.05），而大鼠心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)面積則隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)明顯減少：與造模后1d組相比，3d組大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)/左心室減少（P＜0.05），造模后7d組大鼠缺血危險(xiǎn)區(qū)/全心和危險(xiǎn)區(qū)/左心室均明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5、圖6。圖5見(jiàn)彩插4。

注：與異氟烷組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖2 不同麻醉藥對(duì)大鼠心肌梗死范圍影響Note：Compared with the isoflurane group，#P＜0.05，##P＜0.01.Fig.2 Effect of different anesthesia methods on rat myocardial infarct size

注：與TTC染色組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖4 不同染色方法對(duì)大鼠心肌缺血和梗死范圍影響Note：Compared with the TTC staining group，#P＜0.05，##P＜0.01.Fig.4 Effect of different staining on the rat myocardial AAR and IS

注：與造模后1d組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。圖6 造模后不同時(shí)間對(duì)大鼠心肌缺血和梗死范圍影響Note：Compared with the 1d postoperation group；#P＜0.05，##P＜0.01.Fig.6 Effect of different days post-operation on rat myocardial area-at-risk and infarct size

3 討論

成功制備心肌梗死動(dòng)物模型是研究心肌梗死類(lèi)疾病病理機(jī)制和治療藥物的重要環(huán)節(jié)［4］，麻醉、插氣管、保溫和造模手術(shù)過(guò)程以及術(shù)后護(hù)理等各個(gè)環(huán)節(jié)精細(xì)程度，都直接影響心肌梗死模型制備過(guò)程中動(dòng)物的死亡及心肌缺血/梗死程度［3］。本文主要對(duì)冠脈結(jié)扎法制備心肌梗死大鼠模型過(guò)程中各環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，采用經(jīng)口直視氣管插管，避免切開(kāi)頸部皮膚插氣管引進(jìn)的創(chuàng)傷和感染，插氣管操作要一次成功，避免多次操作傷害氣管組織，即便重復(fù)插氣管操作成功，也會(huì)刺激氣道組織分泌痰液等造成大鼠呼吸不暢導(dǎo)致死亡；手術(shù)過(guò)程的恒溫保溫臺(tái)，以及術(shù)后給大鼠蘇醒前的保溫措施，避免了溫度對(duì)手術(shù)建模和恢復(fù)過(guò)程的影響；切開(kāi)皮膚分離肋間肌暴露心臟過(guò)程盡量使用鈍性分離，以減少組織出血和對(duì)肺部的損傷；開(kāi)胸器撐開(kāi)肋骨以擴(kuò)大手術(shù)視野，結(jié)扎操作一定要在胸腔內(nèi)完成，切勿拉出大鼠心臟進(jìn)行操作，以免心臟移位、動(dòng)脈扭曲造成血液循環(huán)障礙；術(shù)后護(hù)理采取的補(bǔ)水、注射抗生素和祛痰等步驟，能補(bǔ)充代謝所需的體液、預(yù)防感染并及時(shí)清除呼吸道分泌物提高造模大鼠的成活率和恢復(fù)狀態(tài)；大鼠蘇醒后轉(zhuǎn)移到保溫籠，暗室中單只飼養(yǎng)，防止大鼠相互抓咬，減少應(yīng)激，降低術(shù)中或術(shù)后恢復(fù)過(guò)程中動(dòng)物死亡［5］。

戊巴比妥鈉、水合氯醛和異氟烷是目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中常用的麻醉藥，楊簡(jiǎn)、王波、錢(qián)麗萍等分別用戊巴比妥鈉、水合氯醛和異氟烷在大鼠心肌缺血/梗死實(shí)驗(yàn)研究中取得較好效果［6-8］。但許多關(guān)于大鼠心肌梗死模型的文獻(xiàn)資料對(duì)缺血/梗死范圍報(bào)道差異較大，本實(shí)驗(yàn)對(duì)該三種麻醉藥進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以1％異氟烷混合氧持續(xù)麻醉，手術(shù)過(guò)程平穩(wěn)，術(shù)后蘇醒和恢復(fù)較快，但心肌的梗死范圍較小，這可能與文獻(xiàn)報(bào)道的異氟烷對(duì)大鼠缺血性心肌有保護(hù)作用有關(guān)［9-10］；而300mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，手術(shù)過(guò)程順利，但術(shù)后恢復(fù)較慢，且心肌梗死比較嚴(yán)重，在術(shù)后大鼠蘇醒過(guò)程中有一定的死亡率，這可能與水合氯醛麻醉持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)加上模型自身的病理特點(diǎn)導(dǎo)致大鼠基礎(chǔ)代謝差造成機(jī)體能量供應(yīng)不足有關(guān)［11］；與水合氯醛麻醉比較，戊巴比妥鈉45mg/Kg腹腔注射麻醉持續(xù)時(shí)間較短，完全滿(mǎn)足了造模手術(shù)的全部過(guò)程操作，且術(shù)后恢復(fù)相對(duì)較快，術(shù)中和術(shù)后恢復(fù)過(guò)程動(dòng)物死亡低。因此，在大鼠心肌梗死模型制備中，戊巴比妥鈉是三種麻醉藥中更合適的麻醉藥。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是一種脂溶性光敏感復(fù)合物，常用作染色劑檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織的缺血梗塞，它與組織中脫氫酶反應(yīng)產(chǎn)生紅色的脂溶性甲，但梗死組織中脫氫酶活性下降不能與其反應(yīng)，故不被染色呈蒼白色［7］。伊文思藍(lán)作為常用的偶氮染料制劑，因其分子量大小與血漿白蛋白相近而與血漿白蛋白有很高的親和力，因此非梗死區(qū)會(huì)被染成藍(lán)色，而梗死區(qū)不被染色［12］。我們參閱資料［13-15］并試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TTC與伊文思藍(lán)雙重染色能明顯觀(guān)察到正常心肌區(qū)域、缺血危險(xiǎn)區(qū)和梗死區(qū)：正常心肌組織被依文思藍(lán)染為藍(lán)色，缺血危險(xiǎn)區(qū)被TTC染為紅色，而梗死區(qū)不著色呈灰白色，三種顏色更方便觀(guān)察和統(tǒng)計(jì)分析；且本實(shí)驗(yàn)采用2％瓊脂糖凝膠固化伊文思藍(lán)，避免在TTC染色中脫色而造成缺血面積過(guò)大的誤差。采用雙重染色法觀(guān)察大鼠造模后1d、3d和7d心肌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)手術(shù)后時(shí)間對(duì)心肌梗死范圍無(wú)明顯影響，但對(duì)心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)的影響較大：手術(shù)后3～7d，隨時(shí)間的延長(zhǎng)心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)面積逐漸減少。這可為后續(xù)關(guān)于缺血/梗死類(lèi)心臟疾病的病理生理以及相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)研究的起始時(shí)間提供依據(jù)和指導(dǎo)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)大鼠心肌梗死模型制備過(guò)程中麻醉、插氣管、保溫、手術(shù)操作、麻醉藥物、染色方法以及造模后不同時(shí)間進(jìn)行對(duì)比研究表明，戊巴比妥鈉是三種麻醉藥中更合適的麻醉藥，TTC和伊文思藍(lán)染雙重染色對(duì)心肌各區(qū)域范圍評(píng)估更為準(zhǔn)確，且在造模后（3～7）d是開(kāi)展相關(guān)研究的適宜階段。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)大鼠心肌梗死模型制備及其評(píng)價(jià)方法的規(guī)范化以及后續(xù)研究工作提供了較好的借鑒和實(shí)踐依據(jù)。

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［2］雷娟，伍衛(wèi)，薛聲能，等.大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型的建立和評(píng)估［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，4（2）：1-4.

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［5］梅志強(qiáng)，王瓊，鄧?yán)?動(dòng)物福利在研究生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教學(xué)中的應(yīng)用初探b［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22（3）：76-78.

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Improvement of the methods of establishing and evaluating rat models of myocardial infarction

YANG Tao-tao，XIAO Ying，XI Sai-fei，MA Yi-chao，F(xiàn)ANGming-sun，SHOU Qi-yang，PAN Yong-ming CHENmin-li（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

ObjectiveTo optimize the method of establishing and evaluating rat models of myocardial infarction，and improve the reliability and stability of the model.MethodsThe left descending coronary artery in male SD rats was ligated to establish myocardial infarction model.Some important steps such as anesthesia，tracheal intubation，heat insulation，operation technique and postoperative care were improved during the modeling，and the effect of different anesthesia and different postperative days on myocardial infarction size was observed.Different staining methods were used to evaluate the infarction size in the rat myocardial infarction model.ResultsBy comparing the anesthesia time，postoperative recovery and infarction size of each group during the process of myocardial infarction modeling，the sodium pentobarbital was shown to be more appropriate anesthetic.Different days after ligation had no significant effect on the modeling of myocardial infarction（P＞0.05）；but the myocardial ischemia area was significantly decreased with longer postoperative duration（P＜0.01）.2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）and Evans blue double staining clearly visualized myocardial ischemia area and infarction area compared with TTC staining.ConclusionsThe optimized rat models of myocardial infarction in this study improve the animal welfare，and the establishing and evaluating method is more objective and accurate.

Rat；Myocardial Infarction；Model；Method；Improvement

陳民利（1963-），女，教授、碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，E-mail：cmli991@aliyun.com。

R33

A

1671-7856（2014）02-0046-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.002.011

浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（編號(hào)：ZWR2008-43）。

楊濤濤（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理與比較醫(yī)學(xué)，E-mail：tigood@163.com。

2013-11-29