張 麗，陳 煒，張 旭，孫彩顯，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因阿爾茲海默病大鼠模型的建立

張 麗，陳 煒，張 旭，孫彩顯，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的 大鼠的大腦比小鼠更大，是研究神經(jīng)系統(tǒng)的重要模型。建立APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因大鼠，發(fā)展能更全面表現(xiàn)人類阿爾茲海默病表型的動物模型。方法 構(gòu)建人PrP-hAPP695 K595N/M596L、PrP-hPS1dE9和PDGF-TAU轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因大鼠。PCR法鑒定轉(zhuǎn)基因首建鼠及其子代基因型。Western blot檢測轉(zhuǎn)基因大鼠腦組織中人APP、PS1和TAU蛋白的表達(dá)。Morris水迷宮檢測6月齡三轉(zhuǎn)基因大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變。APP、PHF-TAU免疫組織化學(xué)染色觀察三轉(zhuǎn)基因大鼠腦組織APP及TAU的表達(dá)。結(jié)果得到1個同時高表達(dá)人APP、PS1和TAU三個基因的轉(zhuǎn)基因大鼠品系。轉(zhuǎn)基因大鼠6月齡已經(jīng)出現(xiàn)顯著的行為學(xué)改變：學(xué)習(xí)記憶能力下降，病理學(xué)改變表現(xiàn)為過度磷酸化TAU增多和神經(jīng)元胞漿內(nèi)Aβ表達(dá)異常增加。結(jié)論 成功建立了APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)AD大鼠，可做為新一代工具動物模型用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和AD轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。

轉(zhuǎn)基因；微管相關(guān)蛋白Tau；阿爾茲海默?。簧窠?jīng)纖維纏結(jié)；大鼠

阿爾茨海默癥（alzheimer disease，AD）是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，其臨床表現(xiàn)以退行性大腦認(rèn)知，識別功能障礙為特征，有明顯記憶力降低并伴隨個性和行為的改變。AD約占全部癡呆病人的70％，位于心臟病、癌癥和中風(fēng)之后的第四位死亡性疾病，目前已成為發(fā)達(dá)國家主要社會問題之一。AD主要神經(jīng)病理特征包括細(xì)胞外大量由 β淀粉樣蛋白（Aβ）組成的老年斑（senile plaques，SP）、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維絲纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFT）、神經(jīng)細(xì)胞丟失，皮質(zhì)動脈和小動脈的血管淀粉樣變性及大腦皮質(zhì)萎縮［1-2］。

由于Aβ構(gòu)成的老年斑是所有AD患者腦內(nèi)最為突出的神經(jīng)病理特征以及寡聚Aβ呈現(xiàn)顯著的神經(jīng)毒性作用，所以一直以來AD的病理發(fā)生機(jī)制依然是基于Aβ的淀粉樣級聯(lián)假說。然而，新近的研究對這個假說提出了強(qiáng)烈質(zhì)疑。首先，臨床-病理研究發(fā)現(xiàn)部分腦內(nèi)廣泛分布老年斑的患者并無癡呆的表現(xiàn)［3］；其次，與老年斑相比，腦細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維絲纏結(jié)程度與患者臨床癡呆程度有更好的相關(guān)性［4］；此外，迄今為止幾乎所有基于Aβ假設(shè)的治療方案均被臨床研究否決［5］。

現(xiàn)有的動物模型過表達(dá)βAPP可以很好的模擬老年斑沉積的表型，但是不能看到神經(jīng)纖維纏結(jié)。為了讓這兩種病理特征同時出現(xiàn)，需要引入多種基因，因此，國際上已經(jīng)制備了APPSwe，PS1M146V和tauP301L三轉(zhuǎn)小鼠［6-8］。相對小鼠而言，大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與人類更相似，大腦更發(fā)達(dá)，腦容量、表面積均比小鼠大。大鼠智力更高，對新環(huán)境易適應(yīng)，有探索性，易訓(xùn)練，具備對懲罰和暗示敏感的特性，更加有利于并更廣泛地用于行為學(xué)研究和高級神經(jīng)活動的研究，同時，大鼠模型生理數(shù)據(jù)采集及血樣、尿樣采集等簡便，更適合藥物研究，但是迄今為止還沒有建立相應(yīng)的三轉(zhuǎn)基因大鼠。

本研究建立的APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因大鼠，6月齡出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變和神經(jīng)原纖維纏結(jié)病理改變，為AD發(fā)病機(jī)制研究和藥物評價提供了更好的工具動物。

1 材料和方法

1.1 APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠的制備

PrP-hAPP695K595N/M596L、PrP-hPS1dE9和 PDGFTAU轉(zhuǎn)基因載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到 SD大鼠的受精卵中［9］，用SD大鼠（購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK（軍）2007-004；SYXK（軍）2009-003）作假孕受體，制備轉(zhuǎn)基因大鼠（TE2000U顯微注射儀）。實(shí)驗(yàn)中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所實(shí)驗(yàn)動物使用與管理委員會的批準(zhǔn)（ILAS-GC-2010-044）。

1.2 APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠的基因型鑒定

轉(zhuǎn)基因大鼠在出生7 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［10］，用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。APP、PS1、TAU的PCR引物序列見表1（Invitrogen公司合成）。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，共35個循環(huán)。瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物，目的產(chǎn)物長度分別為350 bp、500 bp和500 bp。

表1 APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠的基因型鑒定引物Tab.1 Genotyping primers of APPswe/PS1dE9/TAU transgenic rats

1.3 western blot檢測轉(zhuǎn)基因大鼠腦組織中APP、PS1和TAU的表達(dá)

提取F1代陽性轉(zhuǎn)基因鼠及同窩陰性對照大鼠腦組織總蛋白，BCA法測定濃度，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到0.45μm硝酸纖維素膜上，置于5％的脫脂奶粉封閉液中，室溫1 h，加入TBST稀釋的小鼠抗人Beta Amyloid（A?）6E10單克隆抗體（1∶200，Covance），兔抗人PS1多克隆抗體（1∶1000，ab65293，Abcam），小鼠抗人Tau（D-8）單克隆抗體（1∶100，sc-166060），4℃ 孵育過夜，用TBST洗膜三次，每次10 min。然后加入1∶15000辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠IgG，室溫雜交1 h。采用HRP-GAPDH（康成生物，中國）作為內(nèi)參，將膜置于化學(xué)發(fā)光劑中，用X光膠片曝光、顯影及定影。

1.4 M orris水迷宮檢測轉(zhuǎn)基因大鼠的行為學(xué)變化

選用6月齡轉(zhuǎn)基因大鼠12只及同窩陰性對照大鼠8只，利用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠行為學(xué)分析（Ethovision XT監(jiān)測分析軟件，Noldus公司，荷蘭）。水迷宮宮體（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）直徑200 cm，高50 cm，平臺直徑10 cm，高30 cm。水迷宮實(shí)驗(yàn)過程分為連續(xù)5 d的隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)和第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。每天訓(xùn)練2次，每次使小鼠在不同區(qū)域下水，水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區(qū)域，平臺即第五區(qū)域，位于第4區(qū)域內(nèi)。每次游泳時間為60 s，每次訓(xùn)練間隔1 h左右。小鼠沒有找到平臺的按60 s計算潛伏期，平臺隱藏獲得實(shí)驗(yàn)檢測大鼠學(xué)習(xí)獲得能力，空間探索實(shí)驗(yàn)檢測大鼠空間記憶能力。

1.5 病理學(xué)觀察

選用6月齡行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行后大鼠，麻醉法犧牲大鼠，取出腦組織，10μm冰凍切片。丙酮固定15 min，PBS洗三遍，3％H2O2室溫孵育10 min，0.5％Triton X-100處理5 min。正常山羊血清工作液，室溫封閉60 min。小鼠抗人Beta Amyloid（A?）6E10單克隆抗體（1∶200，Covance），小鼠抗人單克隆抗體（TAU-5）（1∶500，Millipore），小鼠抗人Phospho-PHF-tau pSer202/Thr205 單 克 隆 抗 體（AT8）（1∶50，Thermo Scientific），4℃過夜。山羊抗小鼠IgG-HRP多聚體 （中杉金橋），37℃ 孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

利用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，平臺隱藏獲得實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期采用多重測量的方差分析學(xué)試驗(yàn)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中的各象限的游泳時間和穿越目標(biāo)次數(shù)采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，差異顯著水平設(shè)為設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠的建立

PrP-hAPP695K595N/M596L、PrP-hPS1dE9和 PDGFTAU轉(zhuǎn)基因載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，利用點(diǎn)突變方法使人APP695第595和596位點(diǎn)的氨基酸同時發(fā)生了由賴氨酸突變?yōu)樘扉T冬酰胺與蛋氨酸突變?yōu)榱涟彼岬耐蛔儯Q為瑞士突變。把APP、PS1突變基因分別克隆到小鼠朊蛋白啟動子（PrP）的下游構(gòu)建APP695、PS1dE9轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體。將人TAU基因最長轉(zhuǎn)錄本cDNA克隆到PDGF啟動子下游構(gòu)建PDGF-TAU轉(zhuǎn)基因載體（圖1A）。

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注射到SD大鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入受體假孕Wistar大鼠中，大鼠出生7 d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增鑒定轉(zhuǎn)基因大鼠的基因型（圖1B），共得到3只首建鼠，且均可傳代。分別提取首建鼠的F1代陽性轉(zhuǎn)基因大鼠和同齡對照大鼠腦組織總蛋白，western blot分析，結(jié)果顯示33、34號首建鼠腦組織內(nèi)APP、PS1及TAU蛋白表達(dá)量明顯高于同齡陰性對照大鼠，留種繁育用于行為學(xué)和病理學(xué)分析（圖1C）。

2.2 6月齡APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降

經(jīng)過檢驗(yàn)前5 d學(xué)習(xí)有效，所有大鼠都能較快的找到平臺。隨后第6天撤出平臺，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。Ethovision XT監(jiān)測分析軟件記錄大鼠在目標(biāo)區(qū)域即第4區(qū)（zone4）和平臺區(qū)（platform）的穿梭次數(shù)和停留時間。Morris水迷宮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6月齡APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同月齡野生型小鼠相比有顯著差異，較同窩陰性對照大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力降低（P ＜0.05）（圖2）。

2.3 6月齡APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠腦組織中A?的表達(dá)

APP免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，和野生對照相比，6月齡轉(zhuǎn)基因大鼠腦組織中皮層和海馬神經(jīng)元中A?表達(dá)均顯著增加，但未有明顯老年斑出現(xiàn)（彩插8圖3）。

2.4 6月齡APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠腦皮層出現(xiàn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)

TAU5免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，和野生對照相比，6月齡轉(zhuǎn)基因大鼠腦組織中皮層總TAU蛋白的表達(dá)略有增加。PHF-TAU5免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，野生對照皮層神經(jīng)元內(nèi)無磷酸化PHF-TAU免疫陽性，而轉(zhuǎn)基因大鼠皮層神經(jīng)元有大量磷酸化PHFTAU免疫陽性著色，結(jié)構(gòu)類似神經(jīng)原纖維纏結(jié)（彩插8圖4）。

圖1 APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠的建立Note：A：APPswe、PS1dE9、TAU transgenic expression construct；B：PCR genotyping of APPswe/PS1dE9/TAU transgenic rats；P，positive control；N，negative control；H，H2 O2；M，DL2000 DNA marker；Lanes 1-8 were transgenic rat DNA samples，1，4 and 7 were three founders.C，The expression of human APP，PS1 and TAU in the brain tissues of transgenic ratswere determined by western blot.WT，wild type control rat；33#and 34#were two founders.GAPDH were used as loading control.Fig.1 The generation of APPswe/PS1dE9/TAU transgenic rats

圖2 Morris水迷宮第六天空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note：A，Comparison of target zone duration between 6 month old transgenic and control rats；B，Comparison of target zone frequency between 6 month old transgenic and control rats.*，P ＜0.05.Fig.2 Result of6th day’s probe trial testing ofmorris watermaze trials

表2 6月齡APPswe/PS1dE9/TAU轉(zhuǎn)基因大鼠與野生大鼠在隱藏平臺實(shí)驗(yàn)中搜索平臺潛伏期Tab.2 Escape latencies of 6 month old APPswe/PS1dE9/TAU transgenic rats and wildtype rats in hidden platform acquisition training

3 討論

相對小鼠而言，大鼠在生理、行為等方面與人類更接近［11］。神經(jīng)行為研究的初期，大鼠是最常用的模式生物。大鼠在許多標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)藥理學(xué)任務(wù)中表現(xiàn)良好。大鼠行為表現(xiàn)多樣，情緒敏感，適應(yīng)新環(huán)境快，探索性強(qiáng)，可人為喚起或控制其感覺（動覺、視覺、觸覺、嗅覺），具有行為情緒的變化特征。廣泛應(yīng)用于行為學(xué)及行為異常、高級神經(jīng)活動的研究。此外，大鼠給藥容易，采樣量合適方便，行為多樣化，常用于藥物毒理、藥效評價、新藥篩選等研究。因此，建立APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因大鼠，將為AD發(fā)病機(jī)制研究和藥物評價提供了更好的工具動物。

阿爾茨海默病（alzheimer disease，AD）可分為家族性（FAD）和散發(fā)性或遲發(fā)性（SAD/LOAD）。FAD為常染色體顯性遺傳病，僅占全部AD的l5％以下，而LOAD沒有明顯的遺傳背景，發(fā)病較晚，認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。迄今為止，AD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，主要有幾種假說：β淀粉樣蛋白學(xué)說、Tau蛋白學(xué)說、基因突變學(xué)說、能量代謝障礙學(xué)說等等，其中Aβ、Tau、PS1和ApoE等作為主要的易感基因均在AD的發(fā)病過程中起到重要作用。其中Tau蛋白在AD患者腦中總量多于正常人：正常Tau蛋白減少而異常過度磷酸化Tau蛋白大量增加。Tau過度磷酸化后與微管蛋白的結(jié)合力下降90％，導(dǎo)致AD患者腦中受累神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)廣泛破壞，正常軸突轉(zhuǎn)運(yùn)受損，引起突觸丟失神經(jīng)元功能損傷，發(fā)生腦神經(jīng)退行性病變。由于近年來基于Aβ假設(shè)的治療方案均被臨床研究否決［5］，且與老年斑相比，腦細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維絲纏結(jié)程度與患者臨床癡呆程度相關(guān)性更好［4］，使得Tau基因的相關(guān)研究已經(jīng)成為目前AD研究的焦點(diǎn)。

Cohen RM 等［12］建立了背景為 F344的APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)大鼠，6月齡時Aβ表達(dá)顯著增多，無老年斑出現(xiàn)，行為學(xué)改變不顯著，而直到16月齡和26月齡時才出現(xiàn)老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)，行為學(xué)上表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。本研究建立的APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因大鼠，三轉(zhuǎn)基因大鼠由于引入了第三個基因，表達(dá)人最長轉(zhuǎn)錄本TAU基因，更加有利于從更多層面對AD展開研究。而且，初步的表型研究已經(jīng)顯示出其優(yōu)勢：6月齡時已經(jīng)出現(xiàn)了較為明顯的行為學(xué)改變，雖然無老年斑，但是皮層和海馬神經(jīng)元胞漿內(nèi)Aβ顯著增多，磷酸化的PHF-TAU表達(dá)顯著增加，結(jié)構(gòu)類似神經(jīng)原纖維纏結(jié)。此后，還將就6月齡之后三轉(zhuǎn)基因大鼠的行為學(xué)改變及病理改變進(jìn)行深入和長期的研究，為該模型的使用提供更為詳盡的數(shù)據(jù)。

綜上所述，本研究建立 APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因大鼠，轉(zhuǎn)基因大鼠6月齡即出現(xiàn)出現(xiàn)明顯的行為學(xué)改變，同時還發(fā)生神經(jīng)元胞漿內(nèi)Aβ增多和神經(jīng)原纖維纏結(jié)等病理改變，再現(xiàn)人類阿爾茨海默癥的行為學(xué)及神經(jīng)病理學(xué)特征。而且，由于大鼠壽命長，發(fā)病時程長，觀察窗長，更加有利于開展干涉治療研究，APPswe/PS1dE9/TAU三轉(zhuǎn)基因大鼠的建立為AD發(fā)病機(jī)制研究和藥物評價提供了更好的工具動物。

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Establishment of APPswe/PS1dE9/TAU triple transgenic ratmodel of alzheimer disease

ZHANG Li，CHENWei，ZHANG Xu，SUN Cai-xian，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical CoHege（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To develop amodel that could roundly show the phenotypes of human alzheimer disease （AD），the triple-transgenic ratmodel harboring APP（Swe），PS1dE9，and TAU transgeneswas established in view of the advantage of rat as an important animalmodel on the research of nerve system.M ethods APPswe/PS1dE9/TAU triple transgenic rat AD rats were generated on a SD background by co-injecting rat pronucleiwith two human genes driven by the mouse prion promoter：‘Swedish’mutant human APP（APPsw）and exon 9 mutant human presenilin-1（PS1dE9）and human microtubule-associated protein tau gene under the control of PDGF promoter.Transgene integration was confirmed by genotyping and expression levels were evaluated by western blot（WB）of brain homogenates.The pathological changes were detected by human Abeta，TAU and Phospho-PHF-TAU immunohistochemistry staining（IHC）.The behavioral and cognitive changeswere evaluated by Morris watermaze.Results One transgenic rat lines with high human APP（Swe），PS1dE9，and TAU transgenic expression was selected from three transgenic founders.Compared with the wild type rat，the transgenic rat showed significant learning and memory impairments in the Morriswatermaze at6 months of age.The triple transgenic ratmanifested hyperphosphorylated tau and obvious aggregation of amyloid-β（Aβ）in the brain cortex and hippocampus.Conclusion APPswe/PS1dE9/TAU triple transgenic rat AD modelwas established.The triple transgenic AD rat fills a critical need for a next-generation animalmodel to enable basic and translational AD research.

Transgenic；Microtubule-associated protein tau；Alzheimer’s disease；Neurofibrillary tangles；Rat

R332

A

1671-7856（2014）03-0061-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.013

國家科技支撐計劃課題“神經(jīng)和代謝疾病基因工程模型的建立”（2012BAI39B02）。

張麗，女，助理研究員，博士，E-mail：zhangl@cnilas.org。

張連峰，E-mail：Zhanglf@cnilas.org。

2014-02-24

·科 普·