馬元武，馬 婧，路迎冬，陳 煒，張 旭，于 磊，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰島素受體底物1（Irs1）基因

馬元武，馬 婧，路迎冬，陳 煒，張 旭，于 磊，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100021）

目的 為研究胰島素受體底物1（Irs1）基因與代謝病之間的關(guān)系，我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除大鼠Irs1基因，為研究代謝病提供基因敲除大鼠。方法 針對Irs1第一外顯子，設(shè)計CRISPR/Cas9作用靶點，構(gòu)建sgRNA表達質(zhì)粒。利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄sgRNA和Cas9。將Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中，實現(xiàn)靶基因敲除。用T7EN1實驗初步檢測靶基因的修飾情況，再經(jīng)過測序分析確定突變。結(jié)果 獲得了5個在Irs1基因突變的首建鼠，突變效率為83％。結(jié)論 得到了穩(wěn)定遺傳的Irs1基因敲除大鼠。

Irs1；基因敲除；大鼠；CRISPR/Cas9

大鼠在生理、行為、代謝方面比小鼠更有優(yōu)勢，在研究人類正常和疾病狀態(tài)下的生理生化過程以及藥物臨床前的毒理學(xué)研究中發(fā)揮重要作用［1-3］。胰島素受體底物1（Irs1）是胰島素受體酪氨酸激酶底物，是介導(dǎo)胰島素信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵蛋白，與代謝病關(guān)系密切［4-5］。Irs1作為一個重要的候選基因在2型糖尿病發(fā)病機制研究方面較為深入［6］。Irs1敲除小鼠出生時體重為正常小鼠的一半，4月齡時表現(xiàn)出糖耐受損傷，并伴隨有溫和的胰島素抵抗和高胰島素血癥，是一種較好研究代謝疾病的動物模型［5，7-9］。但小鼠生理、行為、代謝方面與人類存在較大差異，大鼠在這些方面要優(yōu)于小鼠，因此建立Irs1基因敲除大鼠，用于研究胰島素信號傳遞，胰島素抵抗以及與2型糖尿病之間的關(guān)系等，具有非常重要的意義。近幾年的研究表明，一種細菌來源的成簇規(guī)律間隔回文短重復(fù)序列以及臨近相關(guān)基因（CRISPR/Cas9），在從細菌、斑馬魚、到哺乳動物細胞以及小鼠、大鼠等都表現(xiàn)出較強的基因組編輯活性［10-19］。本研究將利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過原核注射的方式用于產(chǎn)生Irs1基因敲除大鼠。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

針對Irs1基因我們設(shè)計了兩個靶點，合成兩對寡聚核苷酸鏈（Rat-IRS1-E1（1）-gRNA：TAGGGCA AAGGCCCACCATGAC和AAACGTCATGGTGGGCCT TTGC；Rat-IRS1-E1（2）-gRNA：TAGGCTGCGGT GGTAGCTGCAG和AAACCTGCAGCTACCACCGCA G）用于制備sgRNA。合成的寡聚核苷酸經(jīng)退火（95℃5min后自然降至室溫），連入經(jīng)Bsa I酶切經(jīng)回收的pUC57-sgRNA表達載體（南京大學(xué)黃興許老師惠贈），構(gòu)建sgRNA表達載體。通過測序驗證連入片段是否正確，選擇正確的克隆，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒用于準備體外轉(zhuǎn)錄模板。

1.2 體外轉(zhuǎn)錄

Cas9表達質(zhì)粒（Addgene No.44758，南京大學(xué)黃興許老師惠贈），經(jīng)Age I酶切線性化，經(jīng)酚氯仿抽提純化后，溶于無核酸酶的水中作為模板，用于體外轉(zhuǎn)錄。Cas9 mRNA的合成由試劑盒T7 Ultra Kit（Ambion，AM1345）在體外利用T7 RNA聚合酶完成。sgRNA的表達載體經(jīng)Dra I酶切線性化后，經(jīng)酚氯仿抽提純化，溶于無核酸酶的水中作為模板，用于體外轉(zhuǎn)錄。sgRNA的體外合成由試劑盒MEGAshortscript Kit（Ambion，AM1354）在體外利用T7 RNA聚合酶完成。

1.3 Cas9/sgRNA的原核注射

轉(zhuǎn)錄好的Cas9 mRNA和sgRNA混合并調(diào)整濃度至20 ng/μL和10 ng/μL/每種sgRNA，顯微注射法將RNA混合物注射到SD大鼠的受精卵的雄性核和細胞質(zhì)中（大鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK（京）2012-0001】），用SD大鼠作為假孕受體大鼠（購自北京維通利華實驗動物有限公司【SCXK（京）2012-0001】），制備轉(zhuǎn)基因大鼠（TE2000U纖維注射儀）。實驗相關(guān)動物在本所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室繁育（【SCXK （京）2013-002】），實驗中涉及動物操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所動物使用與管理委員會批準，批準號為ILAS-GC-2012-001。

1.4 T7EN1酶切實驗

大鼠在出生7～14 d時，用剪腳趾標記法標記，收集剪下的組織，選用經(jīng)典的酚氯仿方法提取基因組DNA，溶于0.1×TE中。設(shè)計一對引物包含sgRNA作用靶點，上游引物為 R-IRS1-S1：5’-CTCACCCAGTTTTTCGACACC-3’，下游引物為 RIRS1-AS1：5’-AGAAGTTCTCTGAGTGGCCACA-3’（上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，中國）。PCR反應(yīng)體系50μL（PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購自寶生物工程有限公司，中國）。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；（95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s）×30；72℃10min；保存4℃。擴增片段大小為687 bp。用PCR純化試劑盒（Takara公司）純化PCR產(chǎn)物。取100 ng純化后的PCR產(chǎn)物在NEB Buffer 2中變性、復(fù)性后，用T7核酸內(nèi)切酶（NEB，M0302L）37℃孵育40 min，然后用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分離。T7核酸內(nèi)切酶能夠識別不完全配對的雙鏈DNA，并進行切割，如果CRISPR/Cas9對靶點造成了突變，將能夠被該酶識別，并造成雙鏈DNA斷裂。因此，在瓊脂糖凝膠電泳中存在除PCR產(chǎn)物帶之外的條帶，說明退火產(chǎn)物能夠被T7核酸內(nèi)切酶識別并切割，表明靶點DNA序列可能存在突變。為進一步驗證突變存在，以及突變情況，我們將通過TA克隆、測序進一步檢測確定突變。

1.5 RT-PCR檢測Irs1的表達情況

頸椎脫臼法犧牲大鼠，提取F1代雜合大鼠和野生（WT）對照大鼠的肝臟、骨骼肌、脂肪、腎臟和脊髓總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Life Technologies）逆轉(zhuǎn)錄 成 cDNA，利 用 引 物 RT-IRS1-F：5’-GGAGGACTTGAGCTATGACACG-3’和 RT-IRS1-F：5’-GAGGATTGTTGAGATGGTGCCT-3’擴增目的基因，大小為437 bp擴增目的基因。GAPDH作為內(nèi)參，確定Irs1在兩種組織中的表達情況，比較雜合子和野生對照大鼠的Irs1表達差異。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA的設(shè)計和打靶載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種相對于 ZFNs和 TALENs更為簡單的基因組編輯技術(shù)，近幾年來引起了廣泛的興趣。Cas9包含有一個HNH基序和三個RuvC基序，分別同源于HNH和RuvC內(nèi)切核酸酶［20-22］（圖1A）。研究表明Cas9能夠在單一的導(dǎo)向性RNA（sgRNA）的作用下，識別含有PAM（Prospace adjacentmotif，NGG基序）靶序列，并實現(xiàn)把DNA序列的雙鏈斷裂（圖1B）。依據(jù)文獻報道的sgRNA的作用靶點設(shè)計方法［10，21，23］，設(shè)計作用靶點。本文中，我們針對Irs1基因設(shè)計了兩個sgRNA作用靶點。依據(jù)sgRNA載體經(jīng)Bsa I形成的粘性末端，合成寡聚核苷酸鏈，經(jīng)退火后連入 pUC57-sgRNA載體中（圖1C），完成sgRNA載體構(gòu)建，經(jīng)測序驗證正確。

圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因打靶示意圖Note：A.Schematic diagram of Cas9.Cas9 containing a nuclear localization signal（NLS）region，flag and a linker region.B.Cas9/sgRNA-mediated gene targeting.The target sequence （blue）is～20 bp and closed to PAM，whereas PAM（red），and the NGGmotif are essential for site recognition and cleavage.C.pUC57-sgRNA expression vector.This sgRNA expression vector containing a kanamycin resistance gene.The annealed oligoswere inserted between the two Bsa I restriction sites.Fig.1 Schematic diagram of CRISPR/Cas9-mediated gene targeting

2.2 產(chǎn)生 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的 Irs1基因突變大鼠

圖2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)Irs1的基因修飾情況Note：M：DNA molecular weight marker DL2000（Takara）；H2O：Template DNA was replaced with water；WT：Template DNA was replaced with wilde type rat genomic DNA；1-6：Rats generated by microinjection.A.Target loci of Irs1 were amplified using genomic DNA templates from founders using primers R-IRS1-S1 and R-IRS1-AS1.B.PCR products were subjected to the T7EN1 cleavage assay to detect themodification in the target loci.Fig.2 CRISPR/Cas9 system mediated genetic modifications in Irs1

Cas9表達質(zhì)粒和sgRNA表達載體，分別經(jīng)Age I和Dra I線性化后，經(jīng)酚氯仿抽提后，作為模板利用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9 mRNA和sgRNA。隨后按Cas9 mRNA（20 ng/μL）和sgRNA （10 ng/μL）混合后，通過原核注射法顯微注射SD大鼠的受精卵。我們通過顯微注射并移植了65個受精卵到2個假孕大鼠中，后來一只孕鼠意外死亡，最后共產(chǎn)生6只大鼠。我們對靶點DNA的PCR擴增，從圖2A中明顯看出這六只大鼠中有5只與野生型條帶相比存在明顯差異。隨后我們靶點擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)T7EN1實驗進一步靶點基因突變情況（圖2B），結(jié)合PCR擴增結(jié)果，只有#5鼠未有明顯變化，說明CRISPR/Cas9在#5鼠中未發(fā)揮作用或發(fā)揮作用后經(jīng)過了正確的修復(fù)，為便于統(tǒng)計，我們認為其未發(fā)生任何基因修飾改變。隨后我們對其余5只可能存在基因修飾的大鼠靶點擴增產(chǎn)物，通過TA克隆、測序最終確定了CRISPR/Cas9對Irs1造成的基因修飾情況（圖3），結(jié)果顯示效率可達83％。

前面的結(jié)果可以看出#2大鼠含有94 bp的缺失基因型，該缺失造成了Irs1基因的移碼突變，并提前產(chǎn)生了終止密碼子，為進一步驗證該技術(shù)造成的缺失是否可以穩(wěn)定傳代。我們將#2大鼠與野生型的SD大鼠進行交配，產(chǎn)生了11只子代大鼠。我們對F1代產(chǎn)生的大鼠，進行了PCR擴增和基因型鑒定，結(jié)果表明該缺失能夠穩(wěn)定遺傳（圖4）。通過本項目的研究，我們利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功實現(xiàn)了對大鼠Irs1基因進行了敲除。

圖3 sgRNA和靶點處DNA序列的結(jié)構(gòu)示意圖Note：PCR amplicon of the targeted fragment in the Irs1 in rats were sequenced.The PAM sequence is underlined and highlighted in green；the targeting site are red；the mutations are blue，lower case；insertions（+），deletions（-）are shown to the rightof each allele.N/N indicates positive colonies out of total sequenced.Fig.3 Schematic diagrams of sgRNAs and DNA sequences of targeting genomic loci

圖4 基因突變的傳代情況分析Note：A.Detection of CRISPR/Cas9-mediated target cleavage of Irs1 in 11 F1 pups derived from founder #2 by PCR amplification.Mutations were detected in 4 F1 pups（2，3，7 and 9）.B.PCR amplicon of the targeted fragment at the Irs1 in potential founder#2-derived F1 pups 2，3，7 and 9 were cloned and sequenced.Sequencing result showed 94 bp deletions same as the founder#2 was detected in the offspring，indicating that amutation induced by Cas9/sgRNA was transmittable.Fig.4 Analysis of the transmission of the targetmutation

在建立了Irs1基因敲除大鼠后，我們對產(chǎn)生的F1代雜合子取了腎臟，骨骼肌，脂肪和脊髓總RNA，利用引物RT-IRS1-F和RT-IRS1-R對Irs1的表達情況進行了分析（圖5），結(jié)果表明Irs1雜合子大鼠在所取組織中表達有明顯的降低。

圖5 RT-PCR分析Irs1在F1代雜合子大鼠中的基因表達情況Note：+/-：wild type SD rat； +/-：Irs1 heterogeneous rat。Primer RT-IRS1-F and RT-IRS1-R were used for gene expression analysis. Gene expression decreased in F1 generation heterogeneous rat.Fig.5 RT-PCR analysis of Irs1 gene expression in F1 heterozygous rat

3 討論

基因敲除技術(shù)作為一種重要基因工程手段在研究基因功能方面發(fā)揮著重要作用?；谂咛ジ桑‥S）細胞基因打靶技術(shù)為精確的遺傳學(xué)修飾提供了一種強有力的手段。在過去的20多年里，該技術(shù)在建立基因敲除、基因敲入和條件性基因敲除小鼠模型發(fā)揮了極為重要的作用［24］。但由于大鼠ES細胞培養(yǎng)條件的限制，直到2010年才建立了第一種基于ES細胞的基因敲除大鼠模型（p53基因敲除大鼠模型）［25］。但目前，基于大鼠ES細胞上水平的遺傳學(xué)修飾不僅時間周期非常長，要經(jīng)歷ES細胞水平打靶、克隆篩選、囊胚注射形成嵌合體，到產(chǎn)生雜合的遺傳修飾大鼠模型需要一年半到兩年的時間，而且ES細胞的培養(yǎng)條件并不非常成熟，對環(huán)境人員要求都非?？量?。這些因素嚴重限制了基因工程大鼠模型的制備。大鼠比小鼠在研究生理、代謝和藥物篩選方面具有更多的優(yōu)勢，近幾年來隨著技術(shù)的發(fā)展，使得大鼠作為一種重要的動物模型開始回歸實驗室。

Irs1是胰島素受體酪氨酸激酶底物，在胰島素刺激引起信號轉(zhuǎn)到中起重要作用，與代謝病關(guān)系密切。本研究利用近年發(fā)展起來的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對大鼠的Irs1基因進行敲除，建立Irs1基因敲除大鼠，效率達83％。本研究為研究胰島素信號傳遞，胰島素抵抗以及與2型糖尿病之間的關(guān)系提供Irs1基因敲除大鼠。

近十幾年的研究，表明基因組編輯技術(shù)如基因組編輯技術(shù)如鋅指核酶（ZFNs）技術(shù)［26-27］、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子（TALENs）技術(shù)［28-30］和CRISPR/Cas系統(tǒng)［31-34］，在從細菌到高等哺乳動物都表現(xiàn)出較高的基因組編輯活性。在應(yīng)用于建立基因敲除小鼠和大鼠模型方面發(fā)揮著極為重要的作用。ZFNs和TALENs需要針對每個設(shè)計的作用靶點，設(shè)計構(gòu)建兩個特異性的質(zhì)粒表達特異性蛋白來實現(xiàn)目的基因的靶向性敲除，設(shè)計和操作相對比較繁瑣，不適用于大部分實驗室。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細菌一套免疫系統(tǒng)，依據(jù)主要的核心組成元件和序列CRISPR/Cas系統(tǒng)組要分為I，II，III型［34］，其中II型來源的Cas9蛋白，表現(xiàn)出非常強的DNA裂解活性。這種核酸酶活性僅僅需要一種非編碼RNA-小導(dǎo)向性RNA（sgRNA）介導(dǎo)下即可實現(xiàn)定向基因打靶［10］，因此 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種相對于 ZFNs和TALENs更為簡便、快速的基因組編輯技術(shù)，在應(yīng)用于基因敲除動物模型的建立方面前景非常廣闊。本研究利用該系統(tǒng)建立Irs1基因敲除大鼠，不僅為代謝病的研究提供了 Irs1敲除大鼠，更使得CRISPR/Cas9作為一種常規(guī)技術(shù)在大鼠敲除模型建立方面也具有非常重要的實際價值。

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Generating insulin receptor substrate 1（Irs1）knockout rat using CRISPR/Cas9

MA Yuan-wu，MA Jing，LU Ying-dong，CHENWei，ZHANG Xu，YU Lei，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China，）

Objective To study the relationship of insulin receptor substrate-1（Irs1）and metabolic disease，we generated Irs1 gene knockout rat by CRISPR/Cas9 system.M ethods Two sgRNA targeting sites were designed for Irs1 targeting.The Cas9 and sgRNAs were transcribed by T7 RNA polymerase in vitro.Cas9 mRNA and sgRNAmixtureswere pooled and microinjected into one-cell fertilized eggs of SD rats to generate ratswith targeted mutation.Results Five rats with themutations were detected with the efficiency of 83％.Conclusion The Irs1 gene knockout rats generated in this study can be transmitted by germline.

Irs1；Gene knockout；Rat；CRISPR/Cas9

R332

A

1671-7856（2014）03-0055-06

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.012

國家科技支撐計劃課題（2012BA139B02）。

馬元武（1983年-），男，博士，研究方向：分子遺傳學(xué)。E-mail：mayuanwu@gmail.com。

張連峰。E-mail：zhanglf@cnilas.org。

2014-02-24

研究報告