高 珊，陳 偉，劉 寧，葛文萍，高 翔，呂 丹，張連峰，董 偉

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

人心肌肌鈣蛋白C兩種突變轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立與對比分析

高 珊，陳 偉，劉 寧，葛文萍，高 翔，呂 丹，張連峰，董 偉

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，北京 100021）

目的 為建立心肌組織特異性表達人cTnCD145E和cTnCG159D突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠，為對比分析兩種不同心肌病的發(fā)生發(fā)展建立模型。方法 利用定點突變技術(shù)分別制備人cTnC基因的cTnCD145E和cTnCG159D兩個突變體，隨后插入心肌特異性表達啟動子α-MHC下游構(gòu)建人cTnCD145E和cTnCG159D基因轉(zhuǎn)基因載體。通過顯微注射法建立轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠。利用心臟超聲和病理觀察對比分析不同年齡轉(zhuǎn)基因小鼠心臟的結(jié)構(gòu)與功能。結(jié)果建立了心肌組織高表達人cTnCD145E和cTnCG159D突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠，cTnCD145E和cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠隨年齡增加，有分別向HCM和DCM發(fā)展的趨勢，12月齡時，cTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠收縮末期和舒張末期左室容積（left ventricle end-diastolic volume and end-systolic volume，EDV and ESV）與同窩陰性小鼠相比下降，射血分數(shù)（ejection fraction，EF）和收縮末期左心室后壁厚度（left ventricle end-systolic posterior wall thickness，ESPWT）增加，而cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠EDV和ESV與同窩陰性小鼠相比上升，EF和ESPWT減少。結(jié)論 心肌組織特異性表達人cTnCD145E突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)肥厚型心肌病病理表型，而心肌組織特異性表達人cTnCG159D突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)擴張型心肌病病理表型，二者可作為對比研究由不同發(fā)病機制導致的心肌病模型。

心肌肌鈣蛋白C；肥厚型心肌病；擴張型心肌??；轉(zhuǎn)基因小鼠；心臟超聲

心肌病主要分為擴張型、肥厚型和限制型三種，其中以擴張型心肌病最為常見。在肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）和擴張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）中，基因缺陷分別占發(fā)病的50％和35％［1-2］，其病理生理機制主要包括肌小節(jié)蛋白基因突變引起的收縮力產(chǎn)生缺陷；細胞骨架蛋白基因突變引起的收縮力傳遞缺陷；ATP調(diào)節(jié)蛋白基因突變引起的心肌能量不足；以及改變的Ca2+可利用性和改變的肌纖維Ca2+敏感性引起的Ca2+內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常［3］。肌鈣蛋白是由3個亞單位，即肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白T組成的復合物，主要依靠肌鈣蛋白T附著于原肌球蛋白，其次是肌鈣蛋白I。肌鈣蛋白c與肌鈣蛋白T和I相互作用。該復合物和原肌球蛋白一起通過調(diào)節(jié)鈣離子對橫紋肌動蛋白ATP酶的活性來調(diào)節(jié)肌動蛋白和肌球蛋白相互作用。心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）是心肌肌肉收縮的調(diào)節(jié)蛋白。cTn是由三種不同基因的亞基組成：心肌肌鈣蛋白 T （cTnT）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和心肌肌鈣蛋白C （cTnC）。cTnC基因有6個外顯子，編碼161個氨基酸的心肌肌鈣蛋白C。鈣離子與心肌肌鈣蛋白C結(jié)合引起肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合物的構(gòu)型改變，從而引發(fā)肌肉收縮。cTnT和cTnI基因突變引起的心肌病比較常見［4-5］，而cTnC基因突變引起的心肌病比較少見，目前報的引起心肌病的cTnC基因突變主要有11個引起HCM和DCM包括L29Q，A8V，C84Y，E134D， Q122A， E59D/D75Y， G159D，Y5H，M103I，D145E，I148等［6］。其中cTnCD145E和cTnCG159D在蛋白結(jié)構(gòu)中的位置相近，但cTnCD145E引起HCM［7］，而cTnCG159D引起DCM［6］。這兩個突變引起兩種相反的表型，建立兩個突變的轉(zhuǎn)基因心肌病模型，可用于對比分析兩種不同心肌病的機制。本文通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別建立了兩種突變的心臟特異轉(zhuǎn)基因小鼠，并對轉(zhuǎn)基因小鼠的心肌病表型進行了長時程對比分析。

1 材料和方法

1.1 人cTnC D145E和cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠建立

人cTnC基因購自Origene公司，利用定點突變技術(shù)分別制備cTnCD145E和cTnCG159D兩個突變體。分別將兩個突變體插入心肌特異性表達啟動子 α-MHC下游構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體。用PvuI內(nèi)切酶將轉(zhuǎn)基因載體線形化，獲得α-MHC啟動的人cTnCD145E和cTnCG159D基因轉(zhuǎn)基因片段。用顯微注射法（TE2000-U顯微注射儀）將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2011-0001】，用ICR小鼠作假孕受體，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK（京）2011-0001】。實驗均在衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室完成【SYXK（京）2013-002】。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準，批準號為ILAS-GC-2011-001。

1.2 RT-PCR及western blot檢測鑒定人cTnC基因的表達

提取cTnCD145E和cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩陰性小鼠心臟 RNA及總蛋白。RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增人cTnC基因全長，選用只在人cTnC DNA中存在的酶切位點的ClaI對擴增產(chǎn)物進行酶切（寶生物工程有限公司，中國），人cTnC的PCR產(chǎn)物被切成兩條帶，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳?？梢来螀^(qū)分 PCR產(chǎn)物中小鼠 cTnC和人cTnC表達的比例。總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上（Millipore美國），置于5％脫脂奶粉封閉液，用鼠抗 cTnC單克隆抗體（LSBio）檢測cTnC的表達水平。采用辣根過氧化物酶（HRP）-耦聯(lián)的羊抗鼠抗體結(jié)合一抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），用HRP-耦聯(lián)的鼠抗GAPDH單克隆抗體做為內(nèi)參。

1.3 小鼠的心臟結(jié)構(gòu)與功能超聲分析

實驗小鼠用三溴乙醇注射麻醉后（0.18 mL/10g體重），用脫毛劑脫去胸部體毛，置于檢測臺上，將臺溫設定為40℃，小鼠四肢用醫(yī)用膠布固定于涂有導電膠的電極上，記錄生理指標。用VisualSonics ?Vevo770?操作系統(tǒng)和專門用于小鼠心臟的RMV707B高頻超聲探頭，進行B型、M型超聲檢測。通過VisualSonics? Vevo770?高分辨率小動物超聲系統(tǒng)的軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 病理觀察

選用12月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，打開胸腔取出心臟，將心臟組織固定在4％多聚甲醛中24 h，進行取材、脫水、包埋、切片、HE染色和鏡下觀察（Nikon顯微鏡，日本和Leica MZ16F體視鏡，德國）。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的建立以及高表達品系篩選

圖1 轉(zhuǎn)基因構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的表達分析Note：NTG：Negative littermates；W：Blank control；M：DNA molecular weightmarker；TG1-5：The positive transgenic mice；The Western blotwas normalized with GAPDH.Fig.1 Transgenic construct and the expression analysis of transgenicmice

用PCR克隆的人cTnC基因，測序結(jié)果表明同已報道的序列完全一致（Gene ID：7134，NM-003280）。將該基因的突變體cTnCD145E和cTnCG159D插入心肌特異性表達啟動子α-MHC下游構(gòu)建人cTnCD145E和cTnCG159D基因轉(zhuǎn)基因載體（圖1A，B）。用RT-PCR和western blot分析兩個突變品系的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中人cTnC基因的表達情況。人cTnC基因與小鼠cTnC基因序列相近，RT-PCR擴增的目的片段大小一致，無法區(qū)分，在人cTnC基因序列中存在ClaI酶切位點，而小鼠中沒有，因此對擴增片段進行酶切，將人cTnC基因與小鼠cTnC基因分離。結(jié)果顯示人cTnC基因在兩個突變品系的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中均有表達，mRNA拷貝數(shù)與內(nèi)源cTnC相當（圖1C），western blot分析結(jié)果顯示人cTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠中，首建鼠TG2的cTnC表達是同窩陰性對照的1倍以上，選擇繁育進一步研究，命名為α-MHC-h-cTnCD145E，在人cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠中首建鼠TG4的cTnC表達是同窩陰性對照的1倍以上，選擇繁育進一步研究，命名為 α-MHC-hcTnCG159D（圖1D）。

圖2 α-MHC-h-cTnCD145E和α-MHC-h-cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠心臟超聲對比分析Note：NTG：Negative littermates；transgenicmice versus NTG，*P ＜0.05，#P＜0.05，＊＊P＜0.01，##P ＜0.01.Fig.2 Analysis the heart ofα-MHC-h-cTnCD145E andα-MHC-h-cTnCG159D transgenic mice with echocardiography

2.2 兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的長時程對比超聲分析

選取年齡、性別匹配的α-MHC-h-cTnCD145E，α-MHC-h-cTnCG159D和同窩陰性小鼠，在1月齡、5月齡、10月齡、12月齡四個時間點，進行為時1年的心臟超聲影像分析，結(jié)果顯示，α-MHC-h-cTnCD145E和α-MHC-h-cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠隨年齡增加逐漸向HCM和DCM發(fā)展，到12月齡時表型最明顯。在與同窩陰性小鼠的收縮末期左室容積比較，α-MHC-hcTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠下降 16％，而 α-MHC-hcTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠增加22％（圖2A）。與同窩陰性小鼠的舒張末期左室容積比較，α-MHC-hcTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠下降 5％，而 α-MHC-hcTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠增加13％（圖2B）。與同窩陰性小鼠的射血分數(shù)比較，α-MHC-h-cTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠增加9％，而α-MHC-h-cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠下降7％（圖2C）。左心室后壁收縮末期厚度直到12月齡才出現(xiàn)明顯變化，與同窩陰性相比，α-MHC-hcTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠增加 6％，而 α-MHC-hcTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠減少4％（圖2D）。

2.3 α-MHC-h-cTnCD145E和α-MHC-h-cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠病理表型分析（封3圖3）

在 α-MHC-h-cTnCD145E，α-MHC-h-cTnCG159D和同窩陰性小鼠經(jīng)過為時1年的心臟超聲影像分析后，犧牲小鼠，取心臟固定，切片和鏡下觀察并與M超聲對比。全心臟切片觀察可見 α-MHC-hcTnCD145E小鼠左心室室壁比同窩陰性小鼠變厚，而α-MHC-h-cTnCG159D小鼠左心室室壁比同窩陰性小鼠變?。▓D3A）。兩種轉(zhuǎn)基因小鼠都表現(xiàn)心肌細胞排列紊亂（圖3B）。M型超聲截圖也顯示α-MHC-hcTnCD145E小鼠左心室室壁變厚，表現(xiàn)HCM表型；α-MHC-h-cTnCG159D小鼠左心室室壁變薄，表現(xiàn)DCM的表型（圖3C）。

3 討論

心肌病是目前發(fā)病率較高，缺乏有效治療方法的一類疾病，肌鈣蛋白T，I，C形成的肌鈣蛋白復合物附著于原肌球蛋白，是鈣離子與心肌肌鈣蛋白C結(jié)合引起肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合物的構(gòu)型改變，從而引發(fā)肌肉收縮的重要組成部分，肌鈣蛋白三個亞基的基因突變是頻率最高心肌病發(fā)病原因［3］。肌鈣蛋白-原肌球蛋白復合物對鈣離子敏感，調(diào)節(jié)肌動蛋白-肌球蛋白相互作用［4-5］。cTnCD145E和cTnCG159D在蛋白的C-結(jié)構(gòu)域附近，D145E突變可以提高cTnC對鈣離子的敏感性［7-8］。G159D突變對cTnC的鈣離子敏感性沒有影響，但可能會增加肌動蛋白-肌球蛋白纖維利用ATP的活性［6］。在人類中cTnCD145E引起HCM而cTnCG159D引起DCM。

我們的結(jié)果表明，在小鼠心臟中特異表達人cTnCD145E突變基因建立的α-MHC-h-cTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠左室容積在收縮末期和舒張末期均明顯下降，射血分數(shù)和左心室后壁收縮末期厚度明顯增加，以及心肌細胞排列紊亂等HCM表型；在小鼠心臟中特異表達cTnCG159D突變基因建立的α-MHC-hcTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠左室容積在收縮末期和舒張末期均明顯增加，射血分數(shù)和左心室后壁收縮末期厚度明顯下降，以及心肌細胞排列紊亂等DCM表型。和人類疾病的表型相似，這兩個突變引起兩種相反的表型，可分別作為HCM和DCM轉(zhuǎn)基因心肌病模型，模型特點是發(fā)病時間較晚，12月齡時表型比較明顯，且到12月齡時沒有猝死發(fā)生。當心肌病隨年齡趨于嚴重時，可能有猝死發(fā)生。cTnC的這一對突變與cTnT的一對突變相比較，cTnTR92Q突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠在10月齡時就有明顯的HCM表型［9］，cTnTR141W突變基因轉(zhuǎn)基因小鼠在4月齡時就有明顯的DCM表型，并且有猝死發(fā)生［10］。α-MHC-h-cTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠和α-MHC-h-cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠更適合作為老年發(fā)病的HCM和DCM模型。

對遺傳性心肌病而言，從基因突變到病理發(fā)生之間不僅突變基因在發(fā)揮作用，參與心肌生長、分化、肥大、凋亡等多方面的信號通路也在發(fā)揮作用?；蛲蛔儧Q定了心肌病的發(fā)生，而參與心肌生長、分化、肥大、凋亡等多方面的信號通路決定著心肌病發(fā)生的快慢和嚴重程度。由同一個基因的兩種突變制備的表型相反的成對模型，如：cTnTR141W轉(zhuǎn)基因DCM模型和cTnTR92Q轉(zhuǎn)基因HCM模型，二者對比分析可以為心肌病的發(fā)生提供很好的機制方面的研究工具，利用二者對比分析，發(fā)現(xiàn)了HepC1和Cyp3A等心肌病的影響基因［11-12］。目前國際上由同一個基因的兩種突變制備的表型相反的成對模型并不多，α-MHC-h-cTnCD145E轉(zhuǎn)基因小鼠和α-MHC-h-cTnCG159D轉(zhuǎn)基因小鼠可用于兩種不同心肌病機制的對比分析，對深入研究心肌病發(fā)病機制具有一定的科學意義。

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Establishment of two cardiac-specific human cardiac troponin C mutation transgenic m ice and com parative analysis

GAO Shan，CHENWei，LIU Ning，GEWen-ping，GAO Xiang，LU Dan，ZHANG Lian-feng，DONGWei
（Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective To established cardiac-specific transgenicmice of the cTnCD145Eand cTnCG159Dand compare the HCM and the DCM.M ethods The cTnCD145Eand cTnCG159Dwere generated by site-directed mutagenesis and the transgenic plasmids were constructed by insertion of themutant genes under the control ofα-MHC，which is amyocardium specific promoter.The transgenicmice were generated by microinjection and were allmaintained on a C57BL/6J genetic backgroud.The cardiac structure and function of the transgenic mice were compared and analysized by echocardiographic and pathological observation at different ages.Results The cTnCD145Eand cTnCG159Dtransgenicmice were established anddeveloped to HCM and DCM，respectively，with aging.The left ventricular end-systolic volume（ESV）and left ventricular end-diastolic volume（EDV）decreased and ejection fraction（EF）and left ventricular end-systolic posterior wall thickness （ESPWT）increased in the cTnCD145Etransgenicmice，while EDV and ESV increased and EF and ESPWT decreased in the cTnCG159Dtransgenic mice at 12 months of age.Conclusions Cardiac-specific human cTnCD145Etransgenic mice showed HCM phenotypes，and cardiac-specific human cTnCG159Dtransgenic mice showed DCM phenotypes，which can be used as differentmodels for comparative study of the pathogenesis of cardiomyopathy.

Cardiac troponin C； Hypertrophic cardiomyopathy； Dilated cardiomyopathy； Transgenic mice；Echocardiography

R332

A

1671-7856（2014）03-0067-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.014

國家科技支撐計劃課題（2O12BAB9BO2）；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項課題（2011ZX09307-302）。

高珊，研究方向：實驗動物學。DWS_GAOSHAN@126.com。

董偉，研究方向：心臟病動物模型與發(fā)病機制，E-mail：dwl30032@126.com。

2014-01-20

研究報告