代 鵬，陳海琴，顧震南，張 灝，陳永泉，陳 衛(wèi)

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)又稱多烯酸，一般指含有的雙鍵個(gè)數(shù)不小于兩個(gè)且碳鏈長(zhǎng)度為16～22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸，可分為ω－6和ω－3等系列。ω－6系列PUFAs主要有亞油酸(Linoleic acid，LA，18∶2)，γ－亞麻酸(γ－Linolenic Acid，GLA，18∶3)、花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA，20∶4)等;ω－3 系列 PUFAs主要有 α－亞麻酸(α－linolenic acid，ALA，18∶3)，二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA，20∶5)，二十二碳五烯酸(Docosapentenoic acid，DPA，22∶5)以及二十二碳六烯酸(Docosapentenoic acid，DHA，22∶6)［1］。

PUFAs中應(yīng)用較為廣泛的有 ARA、EPA、DHA等。ARA是人體前列腺素合成的重要前體物質(zhì)，它具有增加血管彈性和提高免疫力等生理功能，在促進(jìn)嬰幼兒大腦發(fā)育、預(yù)防心腦血管疾病方面以及化妝品、保健品領(lǐng)域都有較好的作用［2］。EPA能降低血液膽固醇水平以及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［3］。DHA是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，在提高嬰幼兒智力等方面具有重要作用。

鑒于PUFAs的應(yīng)用十分廣泛，其生產(chǎn)受到越來(lái)越多的重視。以ARA為例，因其多來(lái)自于動(dòng)物肝臟和魚油等材料，原料來(lái)源受到限制，加上環(huán)境污染等因素，其產(chǎn)量存在不可持續(xù)性風(fēng)險(xiǎn)。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA，由于發(fā)酵條件比較容易控制、油脂產(chǎn)量高和成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到研究者的重視。目前生產(chǎn)ARA的微生物主要有被孢霉、微藻和油脂酵母。本文選擇的目標(biāo)菌株為高山被孢霉，高山被孢霉是目前產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFAs)真菌中唯一具有正式安全性評(píng)估的菌種(GRAS)［4］，其PUFAs含量極為豐富，總的脂肪含量達(dá)到菌體生物量的50%。

高山被孢霉(Mortierella alpina，M.alpina)屬于接合菌綱毛霉目被孢霉科被孢霉屬［5］，為絲狀的腐生菌，廣泛分布于土壤內(nèi)、牲畜的糞便中及其它腐敗的有機(jī)物質(zhì)中。M.alpina的無(wú)性繁殖是依靠無(wú)性孢子進(jìn)行的，無(wú)性孢子多由氣生菌絲體的頂部或側(cè)部細(xì)胞形成，或者是由分生孢子梗等特殊菌絲通過(guò)斷裂成熟而形成。M.alpina通過(guò)接合孢子的產(chǎn)生進(jìn)行有性繁殖，其產(chǎn)脂機(jī)理為當(dāng)M.alpina處于適宜生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件中，細(xì)胞內(nèi)各種代謝活動(dòng)處于平衡狀態(tài)，代謝平衡被打破時(shí)尤其是氮、磷、鋅、鎂等營(yíng)養(yǎng)元素缺乏但碳源充足時(shí)，M.alpina即停止生長(zhǎng)而進(jìn)入脂質(zhì)積累期［6］，通過(guò)限制培養(yǎng)基中的氮源，產(chǎn)脂微生物將多余的碳源轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)。但目前也存在一種共生脂質(zhì)合成機(jī)理，即隨M.alpina的比生長(zhǎng)速率增加，脂質(zhì)合成同步增加，其機(jī)理尚不清楚［7］。M.alpina產(chǎn)生的油脂中不飽和脂肪酸的種類較為豐富，常溫條件下包括LA、GLA、ARA等，低溫條件下還包括ALA、EPA等，圖1是本實(shí)驗(yàn)室總結(jié)的M.alpina ATCC32222中PUFAs合成途徑和脂質(zhì)組數(shù)據(jù)［8］。

圖1 M.alpina ATCC32222中PUFAs合成途徑與脂質(zhì)組數(shù)據(jù)［7］Fig.1 Predicted PUFAs lipoqenesis pathway and lipids detected by lipidomics in M.alpina ATCC32222［7］

M.alpina發(fā)酵生產(chǎn)油脂過(guò)程中，菌體形態(tài)受菌種、氮源和礦物質(zhì)種類、溶解氧含量等因素的影響。M.alpina常見的形態(tài)為絲狀和球狀，在某些條件下呈現(xiàn)放射羽狀的中間形態(tài)。菌體形態(tài)對(duì)M.alpina產(chǎn)PUFAs的影響主要體現(xiàn)在不同形態(tài)下的傳質(zhì)速率不同。Higashiyama等［9］對(duì) M.alpina 1S－4 產(chǎn) ARA 過(guò)程中的形態(tài)變化進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，絲狀和球狀之間可以互相轉(zhuǎn)化并且二者比例保持恒定，小球狀(直徑為1～2mm)菌體中ARA含量明顯高于絲狀和大球狀(直徑2～3mm)菌體中的ARA含量，可能的原因是菌體形態(tài)在絲狀和球狀之間轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，球狀中的受損菌絲以ARA為原料修復(fù)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，導(dǎo)致ARA損耗，同時(shí)與大球狀菌體相比，小球狀菌體的比表面積較大。該結(jié)果與Koike等［10］的研究結(jié)果類似。

目前用于生產(chǎn)ARA的M.alpina的菌株主要有M.alpina ATCC 32222、M.alpina 1S－4、M.alpina CCF185等，本文將探究它們的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響。

1 培養(yǎng)基組分

M.alpina的培養(yǎng)基組分中的主要影響因素包括碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、其他添加物等。其中，碳源種類包括一些糖類如葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、淀粉等，還包括甘油等其它醇類物質(zhì)。有關(guān)氮源的論述包括有機(jī)氮源、無(wú)機(jī)氮源及以此為基礎(chǔ)的混合氮源的影響作用探討。礦質(zhì)元素影響作用的側(cè)重點(diǎn)為其對(duì)菌體形態(tài)的影響，而其他添加物質(zhì)主要作為目的產(chǎn)物的合成前體來(lái)討論。

1.1 碳源的影響

Jang等［11］研究了可溶性淀粉、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘油五種碳源對(duì)M.alpina ATCC 32222產(chǎn)脂能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以硝酸鉀與酵母提取液為2∶1(w/w)作為混合氮源、培養(yǎng)溫度為20℃、碳氮比為5.1～9.0時(shí)，10%的可溶性淀粉溶液對(duì)M.alpina產(chǎn)ARA和PUFAs的促進(jìn)作用最強(qiáng)，該條件下每克碳源可產(chǎn)生17.4mg LA、17.0mg GLA、103.0mg ARA 以及194.2mg總PUFA。

Nisha等［12］比較了葡萄糖、果糖、淀粉、棉籽糖、鼠李糖、甘露糖對(duì)M.alpina CBS 528.72生物量及產(chǎn)脂的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖對(duì)該微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的作用效果最好，生物量和總脂量分別為6.8g/L和40.2%(w/w)。含鼠李糖培養(yǎng)基產(chǎn) ARA最多，達(dá)40.41%，但鼠李糖的生產(chǎn)成本較高，不適宜大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。

鑒于合成培養(yǎng)基成本較高，不利于M.alpina工業(yè)化生產(chǎn)PUFAs，因此探究使用天然培養(yǎng)基如工業(yè)廢液作為生產(chǎn)原料顯得尤為重要。Cheng等［13］對(duì)M.alpina NRRL 5513利用蔗糖廢液、豆粕廢液和粗豆油生產(chǎn)EPA進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，利用豆粕廢液與粗豆油進(jìn)行生產(chǎn)，M.alpina NRRL 5513在變溫培養(yǎng)條件下的EPA產(chǎn)量可達(dá)總脂的13%(w/w)，這表明在一定的條件下使用天然培養(yǎng)基作為M.alpina的發(fā)酵產(chǎn)脂的生產(chǎn)原材料，在顯著降低成本的同時(shí)仍能滿足工業(yè)生產(chǎn)要求。

1.2 氮源的影響

Park等［14］研究了氮源對(duì)M.alpina產(chǎn)生 ARA的影響，并使用鏡像分析系統(tǒng)對(duì)菌絲體的幾何性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所用氮源為酵母提取液、蛋白粉、玉米漿時(shí)，菌絲體多為球型，而使用棉籽粉、魚精粉、豆粕粉作為氮源時(shí)，菌絲體呈含絲狀結(jié)構(gòu)的放射羽狀。豆粕培養(yǎng)后發(fā)酵液中的絲狀結(jié)構(gòu)比例達(dá)75%，每克細(xì)胞干重中ARA含量為0.14g，為酵母提取液中的兩倍，同時(shí)表明放射羽狀的菌體形態(tài)更適合M.Alpina發(fā)酵生產(chǎn)ARA。

Nisha等［12］比較了蛋白胨、酵母提取液、硝酸鈉、硫酸銨、硝酸鉀、尿素、硝酸銨、氯化銨、酪蛋白作為氮源對(duì)M.alpina產(chǎn)ARA的影響，盡管使用蛋白胨時(shí)菌體產(chǎn)總脂量最多，達(dá)42.0%(w/w)，但ARA產(chǎn)量?jī)H占總脂含量的28.74%，低于用酵母提取液時(shí)的ARA所占總脂含量(35.28%)。其他幾種物質(zhì)作為氮源時(shí)效果均不夠理想。

本實(shí)驗(yàn)室張靜等［14］采用脫脂豆粉和硝酸鉀比例為3∶2作為氮源，培養(yǎng)至192h時(shí)，與硝酸鉀單獨(dú)作為氮源相比，使用混合氮源條件下ω－3 PUFAs的產(chǎn)量略有下降，而發(fā)酵成本可以大幅度的降低，可滿足大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)要求。這與Jang等［11］的研究思路類似，以硝酸鉀與酵母提取液為2∶1(w/w)作為混合氮源來(lái)生產(chǎn)ARA時(shí)效果最佳。因此使用混合氮源是M.alpina進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs的最好選擇。

1.3 礦質(zhì)元素的影響

Higashiyama等［16］研究了不同的礦質(zhì)元素對(duì)M.alpina 1S－4的菌絲形態(tài)和ARA產(chǎn)量的影響。在添加一定濃度的 K+、Na+、Ca2+、Mg2+時(shí)，M.alpina 菌絲形態(tài)為直徑1～2mm的小球狀。若只添加K+，菌絲體的主要形態(tài)為絲狀，這會(huì)導(dǎo)致表觀黏度增加，因而需要更高的剪切力，最終導(dǎo)致菌體受到破壞。若培養(yǎng)液中只添加 Na+、Ca2+、Mg2+，M.alpina 菌體形態(tài)為直徑2～3mm的大球形，導(dǎo)致傳質(zhì)受阻而使ARA產(chǎn)量降低。推測(cè)可能的原因是添加了K+情況下的菌體初始生長(zhǎng)速率較高，形成的較長(zhǎng)菌絲因攪拌而破裂后形成了大量的菌絲片段，進(jìn)而產(chǎn)生了大量的絲狀菌體。Ca2+等聚合陽(yáng)離子可引起菌絲體聚合成球狀［17］。

范益春［18］等研究了磷限制對(duì)M.alpina產(chǎn)脂情況的影響，在限制磷(初始磷濃度為0.7g/L)的條件下，發(fā)酵周期可由7d縮短至5d，細(xì)胞干重和油脂含量分別達(dá)到42.6g/L和21.6g/L，相比原始條件下分別提高了14.8%和11.3%，這也印證了前述的產(chǎn)脂機(jī)理。

1.4 其他添加物的影響

其他添加物主要指除碳、氮源等基本培養(yǎng)基組分外的有利于M.alpina產(chǎn)脂的物質(zhì)，一般這種物質(zhì)主要作為目標(biāo)產(chǎn)物的合成前體并可能兼有碳氮源的作用，或者可以作為微生物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)因子。Shimizu 等［19］利用 M.alpina 20－17 生產(chǎn) EPA 時(shí)，在以葡萄糖、酵母膏為主要碳、氮源的培養(yǎng)基中添加或不添加α－亞麻酸，28℃培養(yǎng)，結(jié)果添加有α－亞麻酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲中有較高含量的EPA產(chǎn)生，產(chǎn)量為63.1μg/mL。在最佳培養(yǎng)條件下培養(yǎng)M.alpina 20－17，結(jié)果亞麻籽油中5.1%α－亞麻酸轉(zhuǎn)化為EPA，且EPA產(chǎn)量達(dá)到1.35g/L(4.15mg/g干菌絲)，相當(dāng)于總菌體脂肪酸的7.1%。鮑時(shí)翔等［20］用Mortierella sp.M10發(fā)酵生產(chǎn)ARA時(shí)在培養(yǎng)基中添加一定量的玉米油、橄欖油和豆油，結(jié)果顯示它們均有利于ARA的合成，其中以添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%橄欖油時(shí)的效果最好。

Jang等［11］比較了玉米油、豬油和亞麻籽油三種不同添加物對(duì)M.alpina ATCC 32222產(chǎn)脂的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加亞麻籽油的效果最好，每克碳源可產(chǎn)生403.4mg ALA、123.1mg ARA、33.6mg EPA 以及共943.2mg 總 PUFAs。

Yu等［21］在M.alpina M18培養(yǎng)基中添加谷氨酸鹽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷氨酸鹽的添加有利于M.alpina的生長(zhǎng)、底物代謝和ARA的產(chǎn)生，并且0.8g/L谷氨酸鹽的促進(jìn)效果最好，產(chǎn)ARA達(dá)1.41g/L，比對(duì)照組高出0.56g/L。此外添加B族維生素能夠促進(jìn)M.alpina產(chǎn)生ARA［22］，這主要是因?yàn)锽族維生素可作為ARA合成過(guò)程中關(guān)鍵酶如蘋果酸脫氫酶等的輔酶。

2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件主要涉及培養(yǎng)基中的碳氮比、溶氧量、溫度、pH及初始葡萄糖濃度等。它們的共同點(diǎn)是都作為M.alpina生長(zhǎng)和產(chǎn)脂創(chuàng)造基本的培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)各因素的側(cè)重點(diǎn)又有所不同，比如研究碳氮比和溶氧量時(shí)，主要側(cè)重于它們對(duì)菌體形態(tài)變化的影響。

2.1 碳氮比的影響

Stredanska等［23］以葡萄糖為碳源、硝酸鈉為氮源時(shí)來(lái)研究碳氮比對(duì)M.alpina CCF185發(fā)酵生產(chǎn)ARA的影響，發(fā)現(xiàn)碳氮比為40時(shí)ARA產(chǎn)量最高，但碳氮比對(duì)ARA產(chǎn)量影響不顯著。該研究所選取的碳氮源種類較少，并且沒(méi)有對(duì)碳氮源對(duì)菌體生物量以及形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化的影響作深入探究。

Koike等［10］從搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)兩個(gè)方面研究了培養(yǎng)基的碳氮比對(duì)M.alpina CBS754.68菌體形態(tài)和ARA產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在碳源和氮源初始總濃度為50g/L時(shí)，碳氮比低于7時(shí)，隨碳氮比升高細(xì)胞生長(zhǎng)量明顯增加;碳氮比為7～15時(shí)，碳源被利用的方向從細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向脂類合成;碳氮比為15～32時(shí)，脂類合成十分活躍;當(dāng)碳氮比高于15時(shí)，氮源的限制作用導(dǎo)致菌體生物量減小，但脂類合成仍然增加。氮過(guò)量時(shí)，生物量與氮源量成正相關(guān)，而ARA合成量與氮源量成負(fù)相關(guān)。碳源過(guò)量時(shí)，總脂肪酸含量與氮源量成正相關(guān)而ARA保持不變。從ARA合成方面來(lái)說(shuō)，適宜碳氮比為15～20，在該范圍內(nèi)，菌體顆粒體積和環(huán)狀區(qū)域的寬度并未隨碳氮比變化而發(fā)生改變，即碳氮比對(duì)菌體形態(tài)影響不大。然而，碳氮比高于20時(shí)，菌體顆粒體積和環(huán)狀區(qū)域的寬度隨碳氮比增大而增大。

2.2 溶解氧含量的影響

Higashiyama等［24］用兩種方法，即溶解氧法和頂壓法研究了在3～50ppm范圍內(nèi)溶解氧(dissolved oxygen，DO)含量對(duì) M.alpina 1S－4的菌體形態(tài)和ARA合成的影響。溶解氧法中，采用純度20%～90%的氧氣供應(yīng)，而頂壓法則控制頂壓為180～380kPa。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最適DO量為10～15ppm，該條件下ARA產(chǎn)量為7ppm下的1.6倍。溶解氧法中的DO量超過(guò)15ppm時(shí)，菌體形態(tài)由絲狀或羽狀向球狀轉(zhuǎn)變，可能的原因是高氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能引起菌體表面的部分結(jié)構(gòu)裂解，進(jìn)而形成較為光滑的球狀，同時(shí)導(dǎo)致ARA產(chǎn)量下降。頂壓法中的菌體形狀并未發(fā)生明顯改變，這可能由于溶解的CO2的量的增大，CO2對(duì)ARA產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)增加［25］。實(shí)際生產(chǎn)中溶解氧法更為實(shí)用。

2.3 溫度的影響

M.alpina生長(zhǎng)及產(chǎn)脂的適宜溫度范圍為15～25℃，低溫利于產(chǎn)脂，但同時(shí)會(huì)降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率。在20℃下培養(yǎng)，其延滯期為34h，對(duì)數(shù)期介于72h和120h，穩(wěn)定期介于120h和168h，192h后進(jìn)入衰亡期，72h菌體產(chǎn)GLA最多，120h產(chǎn)ALA最多，144h產(chǎn)總PUFA 最多［11］。Baipai等［26］認(rèn)為溫度由 25℃ 升至28℃時(shí)，M.alpina ATCC 32222的生物量和ARA產(chǎn)量明顯降低，10～15℃內(nèi)才可檢測(cè)到EPA，表明不同種類的PUFA的發(fā)酵生產(chǎn)適宜的溫度存在差異。

Peng等［27］在 15～25℃ 范圍內(nèi)研究了 M.alpina ME－1產(chǎn)ARA的溫度調(diào)控狀況，結(jié)果表明M.alpina生長(zhǎng)的最適溫度為25℃，ARA積累的最適溫度為20℃，因而采用變溫培養(yǎng)策略。實(shí)驗(yàn)中前108h采用25℃，之后采用20℃，采用此方法后細(xì)胞干重由34.7g/L增至36.7g/L，ARA產(chǎn)量由7.3g/L增至9.2g/L，后者增幅達(dá)26.1%。對(duì)M.alpina CBS 528.72的研究發(fā)現(xiàn)，溫度高于30℃或低于25℃時(shí)菌體生長(zhǎng)被拖延，高于35℃菌體則停止生長(zhǎng)，產(chǎn) ARA最適溫度為25℃［12］。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 Cohen 等［28］的研究結(jié)果不同的原因是實(shí)驗(yàn)菌株有差異，由于低溫下溶解氧含量較高而同時(shí)去飽和酶為氧依賴型所致。

2.4 pH的影響

pH對(duì)M.alpina的生物量和ARA產(chǎn)量均產(chǎn)生影響。pH低于4或高于9時(shí)，M.alpina菌體完全停止生長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的適宜pH范圍為5.5～6.5。初始pH為6.0～6.5對(duì)生物量不產(chǎn)生顯著影響。培養(yǎng)環(huán)境pH為6.0時(shí)總脂產(chǎn)量最高，6.5時(shí)ARA產(chǎn)量最大(占總脂 34.72%)［12］，這與 Lindberg 等［29］的研究結(jié)果相吻合，后者在25℃和pH為6.5時(shí)獲得最高的ARA的產(chǎn)量(占總脂量的31%)。

2.5 初始葡萄糖濃度的影響

由前所述可知含高濃度碳源、低濃度氮源的培養(yǎng)基有利于M.alpina產(chǎn)脂，但是初始葡萄糖濃度過(guò)高對(duì)M.alpina的生長(zhǎng)有抑制作用，主要原因是高濃度葡萄糖形成的高滲透壓使M.alpina失水，從而影響菌體的正常生長(zhǎng)。解決的方法除了采用甘油替代葡萄糖作為碳源外，還可以在直接使用葡萄糖作為碳源的條件下，通過(guò)先控制相對(duì)較低的初始葡萄糖濃度而在后續(xù)培養(yǎng)中通過(guò)補(bǔ)料的方法實(shí)現(xiàn)。Zhu等［30］發(fā)現(xiàn)低初始葡萄糖濃度(50g/L)和氮源含量為3g/L的條件可縮短延滯期，20g/(L·d)的葡萄糖和1.5g/(L·d)的硝酸鹽在第3、4、5d 加入，第8d 可得到最多ARA(7.74g/L)。實(shí)際應(yīng)用中在縮短延滯期的同時(shí)應(yīng)使最終的發(fā)酵時(shí)間縮短。

3 高山被孢霉菌種改良

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)M.alpina產(chǎn)PUFAs合成通路的研究主要集中在脂肪酸合成途徑中脫飽和酶和延長(zhǎng)酶的功能驗(yàn)證。采用的手段包括:通過(guò)物理或化學(xué)誘變使通路中的某個(gè)酶失活，進(jìn)而通過(guò)分析PUFAs產(chǎn)物反推其催化底物的能力;根據(jù)相關(guān)物種中PUFAs通路酶的序列同源性，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到基因后將其克隆至異源宿主菌進(jìn)行功能驗(yàn)證［31］;通過(guò)過(guò)表達(dá)PUFAs通路中關(guān)鍵的酶基因，提高對(duì)應(yīng)多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。目前在這方面關(guān)于M.alpina的研究集中于 M.alpina 1S－4和M.alpina ATCC32222(另一保藏菌名為M.alpina CBS 210.32)兩株菌。典型的研究工作包括 Eiji Sakuradani［32］等已確定兩株ω－3脫飽和酶缺陷型菌株中ω－3脫飽和酶的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)的氨基酸被取代從而導(dǎo)致ω－3脫飽和酶活性喪失。Kikukawa等［33］將 ω－3脫飽和酶基因從M.alpina 1S－4中分離后導(dǎo)入酵母中進(jìn)行表達(dá)，從而確認(rèn)了此基因的多重功能。對(duì)M.alpina進(jìn)行分子改造也受到了越來(lái)越多的重視，Ando等［34］通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)過(guò)量表達(dá)M.alpina 1S－4中的ω－3基因，可使EPA產(chǎn)量提高 10倍。Sakuradani等［35］發(fā)現(xiàn)，在 M.alpina野生型菌株和M.alpina 1S－4的delta－5脫飽和酶缺陷型菌株中過(guò)表達(dá)內(nèi)源性ω－3基因后，EPA達(dá)到了總脂含量的30%。但另有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)該缺陷型菌株進(jìn)行基因缺陷修復(fù)后EPA的含量同樣上升，所以這方面的研究還缺乏一個(gè)很好的研究體系，今后的研究將會(huì)集中于選擇更為嚴(yán)格的表達(dá)系統(tǒng)。

國(guó)內(nèi)的相關(guān)專利包括一種花生四烯酸產(chǎn)生菌高山被孢霉的誘變篩選方法［36］等，僅限于較為基礎(chǔ)的菌種的篩選和誘變，本實(shí)驗(yàn)室在M.alpina培養(yǎng)條件優(yōu)化和菌種分子生物學(xué)改造方面也進(jìn)行了一些前期研究工作［7，15，37］。國(guó)外的相關(guān)專利涉及 M.alpina 中脂肪酸 C16/18 延長(zhǎng)酶［38］和磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶［39］等的功能研究，此外還包括有關(guān)M.alpina發(fā)酵生產(chǎn)二十碳二烯酸等［40］發(fā)酵工藝方面的國(guó)際專利。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于M.alpina培養(yǎng)基條件優(yōu)化多限于實(shí)驗(yàn)室研究，即探究合成或半合成培養(yǎng)基對(duì)M.alpina產(chǎn)脂的影響，該類研究尚未應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)。

4 展望

目前在研究M.alpina生產(chǎn)PUFAs過(guò)程相關(guān)酶時(shí)所使用的體系尚不健全，今后的研究將會(huì)集中于選擇較完善的表達(dá)系統(tǒng)。伴隨著對(duì)M.alpina中涉及PUFAs合成相關(guān)酶的作用機(jī)理逐步清晰，構(gòu)建具有目標(biāo)導(dǎo)向的高山被孢霉基因工程菌對(duì)M.alpina在產(chǎn)功能性PUFAs的應(yīng)用方面具有非常重要的意義。在此基礎(chǔ)上利用天然碳源和氮源設(shè)計(jì)較為廉價(jià)的培養(yǎng)基進(jìn)行M.alpina高產(chǎn)PUFAs的研究工作具有很大的實(shí)際意義，并為發(fā)展利用菌體生產(chǎn)菌飼料的研究提供有力保障。M.alpina生產(chǎn)ARA等不飽和脂肪酸在發(fā)酵條件探究和生產(chǎn)安全性上可行，加上人們對(duì)健康的日益重視，PUFAs的需求量必將進(jìn)一步增加，甚至可能在短時(shí)間內(nèi)激增，因而M.alpina發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs具有廣闊的市場(chǎng)前景。

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