王曉楠，藺立杰，2，王豐俊，*

(1.北京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程系，北京100083;2.煙臺(tái)大學(xué)環(huán)境與材料工程學(xué)院，山東煙臺(tái)264005)

醬油是我國(guó)傳統(tǒng)的釀造調(diào)味品，營(yíng)養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨(dú)特，含有多種氨基酸、有機(jī)化合物和礦物質(zhì)［1］。長(zhǎng)期以來(lái)，釀造醬油是以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉質(zhì)原料為輔料，經(jīng)米曲霉制曲、發(fā)酵釀制而成［2］。如何因地制宜，就地取材，綜合利用，來(lái)拓寬醬油生產(chǎn)蛋白質(zhì)類原料的來(lái)源，成為當(dāng)務(wù)之急。目前，已有利用花生餅、玉米渣、大米蛋白渣等生產(chǎn)醬油的報(bào)道，但利用核桃粕釀造醬油鮮有報(bào)道。核桃位居世界四大堅(jiān)果之首［3］，具有很高的食用價(jià)值，在國(guó)內(nèi)資源豐富，是傳統(tǒng)的食品加工原料［4－5］。核桃粕是核桃經(jīng)過(guò)物理壓榨提取出大部分油脂后剩下的部分，蛋白含量可達(dá)到40%左右［6］，在核桃蛋白中含有18種氨基酸，有8種必需氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸含量較高［7］，而核桃蛋白制品品種較少，主要有核桃粉、濃縮蛋白、分離蛋白、蛋白肽等［8］。以榨油后的核桃粕為蛋白原料生產(chǎn)核桃醬油，蛋白含量充足且利用率很高［6］。既為核桃的綜合利用提供了廣闊的前景，有利于提高核桃粕附加值，又為生產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)醬油提供了方向。本研究在低鹽固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)上以核桃粕代替大豆釀造醬油，控制發(fā)酵工藝、跟蹤檢測(cè)理化指標(biāo)、探討發(fā)酵規(guī)律，進(jìn)而優(yōu)化工藝條件，為醬油釀造提供新材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃粕 由河北晶品果業(yè)有限公司提供，油脂含量為32%;麩皮 購(gòu)于北京本鄉(xiāng)面粉廠;滬釀3.042 北京林業(yè)大學(xué)微生物系提供;培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

DHP－9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;LDZX－40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;B－260型恒溫水浴鍋上海亞榮生化儀器廠;KDY－9830凱氏定氮儀 北京瑞邦興業(yè)科技有限公司;95－1磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 原料→潤(rùn)水→蒸煮→冷卻→接種→制曲→發(fā)酵→淋油→成品

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 種曲培養(yǎng)基［9］按照麩皮∶豆粕質(zhì)量比為4∶1的比例在250mL三角瓶中加入20g過(guò)10目篩的干料，12g蒸餾水，拌勻。121℃，0.1MPa滅菌30min。

1.2.2.2 制曲 核桃粕、麩皮和面粉按55∶40∶5的比例混合，加入原料總重量115%的水混合拌勻，潤(rùn)水20min后蒸料，在0.15MPa滅菌32min。熟料冷卻到40℃左右，按接種量0.5%(原料重量計(jì))接入三角瓶菌種拌勻。制曲過(guò)程控制品溫28～32℃，最高不超過(guò)35℃，制曲時(shí)間在33h，待曲料疏松、孢子叢生、無(wú)夾生、無(wú)異味、無(wú)其他霉菌，具有正常曲香時(shí)，即為成曲［10］。

1.2.2.3 發(fā)酵 將成曲粉碎按照一定的比例加入鹽水混勻裝入發(fā)酵容器中，保溫發(fā)酵。鹽水濃度為12～13°Bé，發(fā)酵時(shí)間 7d左右。當(dāng)醬醅呈紅褐色，有光澤，不發(fā)烏，醅層顏色一致，且柔軟，松散不黏，不干燥，無(wú)硬心，有醬香時(shí)，即為成熟醬醅［11］。醬醅在90℃下浸泡后淋油，經(jīng)12h后取上清液得到生醬油，測(cè)其理化指標(biāo)。

1.2.3 研究低鹽固態(tài)發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 鹽水原料比對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 在發(fā)酵工程中，鹽水和成曲的比例，即鹽水原料比對(duì)氨基酸的生成率有很大的影響，也影響發(fā)酵周期。在鹽水原料比為 1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1 條件下把成曲與鹽水混勻，將混合物置于發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為45℃，發(fā)酵時(shí)間為6d，檢測(cè)不同鹽水原料比條件下醬油中氨基態(tài)氮的含量。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 以鹽水原料比為1.5的比例把成曲與鹽水混勻，將混合物置于發(fā)酵罐中，分別在 32、36、40、44、48℃溫度下發(fā)酵 6d，檢測(cè)不同發(fā)酵溫度條件下醬油中氨基態(tài)氮的含量。

1.2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 以鹽水原料比為1.5的比例將成曲與鹽水混勻，將混合物置于發(fā)酵罐中，在45℃的發(fā)酵溫度，分別發(fā)酵2、4、6、8、10、12、14d，檢測(cè)不同發(fā)酵時(shí)間條件下醬油中氨基態(tài)氮的含量。

1.3 發(fā)酵工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

以氨基態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，依次進(jìn)行鹽水原料比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)，并確定三因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.4 測(cè)定方法

氨基態(tài)氮含量的測(cè)定:采用GB/T 5009.39－2003方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 鹽水原料比對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 鹽水原料比對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響結(jié)果見圖1。從圖1可知，當(dāng)鹽水原料比為1.5時(shí)，氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大，隨著鹽水原料比進(jìn)一步增加，氨基態(tài)氮含量大幅下降。食鹽能抑制雜菌生長(zhǎng)，但也是各種酶活力的抑制劑，隨著食鹽含量的增加，會(huì)抑制酶的活力，減弱其對(duì)蛋白質(zhì)的分解能力，致使氨基態(tài)氮含量下降。

圖1 鹽水原料比對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.1 Influence of the ratio of brine and material on the formation of amino acid nitrogen

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 發(fā)酵過(guò)程中控制鹽水原料比為1.5，發(fā)酵時(shí)間為6d，設(shè)置不同的發(fā)酵溫度，研究發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在32～44℃之間氨基態(tài)氮含量平穩(wěn)上升，到44～48℃之間大幅度下降。這是因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中酶活力與溫度有一定的關(guān)系，酶有最適的作用溫度，如果溫度過(guò)高，酶結(jié)構(gòu)遭到的破壞，酶活力下降，對(duì)蛋白質(zhì)的分解減弱，進(jìn)而影響氨基態(tài)氮含量。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.2 Influence of fermentation temperature on the formation of amino acid nitrogen

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響結(jié)果見圖3。如圖所示，氨基態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，6d以后氨基態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定。發(fā)酵初期，醬醅中的蛋白質(zhì)只是初步被酶解，而在第5d時(shí)大部分蛋白質(zhì)已被酶解完成，直至8d時(shí)酶解基本完成，并趨于平衡。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以鹽水原料比(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時(shí)間(C)為實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.3 Influence of fermentation time on the formation of amino acid nitrogen

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

通過(guò) Design Expert軟件中的 Box－Behnken Design模型對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到回歸方程為:Y=0.84+0.055A+0.044B－0.025C+0.015AB+6.000E－003AC+0.051BC－0.096A2－0.061B2－0.04C2對(duì)模型進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著(p＜0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型R2=0.9674，R2Adj=0.9306，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好［12］，能夠很好地反映響應(yīng)值，可以用于核桃醬油發(fā)酵工藝實(shí)驗(yàn)的預(yù)測(cè)。

通過(guò)表3 中:F(A)=42.83，F(xiàn)(B)=28.07，F(xiàn)(C)=9.28，可知各因素對(duì)發(fā)酵條件的影響程度大小順序?yàn)?鹽水原料比＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。由顯著性檢驗(yàn)結(jié)果得:回歸方程一次項(xiàng)A、B極顯著，C顯著;二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著;交互項(xiàng)除BC外，其他均不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 利用Design Expert 8.0.6軟件，作出各因素對(duì)氨基態(tài)氮含量的響應(yīng)面分析圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析鹽水原料比、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響。通過(guò)圖4～圖6可知，鹽水原料比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間與氨基態(tài)氮含量有顯著的相關(guān)性，表現(xiàn)為曲面較陡，其中鹽水原料比對(duì)氨基態(tài)氮含量影響最大。結(jié)合等高線的疏密程度可知［13］，發(fā)酵溫度與發(fā)酵時(shí)間的交互作用影響顯著，鹽水原料比與發(fā)酵溫度、鹽水原料比與發(fā)酵時(shí)間兩兩之間有一定的交互作用，但交互作用的影響不顯著。

2.2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化與驗(yàn)證 依據(jù)Design Expert軟件進(jìn)行優(yōu)化配置，得到最佳工藝條件為鹽水原料比1.65，發(fā)酵溫度45.51℃，發(fā)酵時(shí)間5.95d，氨基態(tài)氮含量的理論值為0.854g/100mL?？紤]實(shí)際操作條件，將上述最佳發(fā)酵條件修正為鹽水原料比1.65，發(fā)酵溫度45℃，發(fā)酵時(shí)間6d。該條件下平行3次測(cè)氨基態(tài)氮含量均值為 0.835g/100mL，相對(duì)誤差為2.22%，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合很好，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

圖4 鹽水原料比和發(fā)酵溫度對(duì)氨基態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of brine－to－material ratio and fermentation temperature on the formation of amino acid nitrogen

圖5 鹽水原料比和發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of brine－to－material ratio and fermentation time on the formation of amino acid nitrogen

圖6 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)氨基態(tài)氮含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of fermentation temperature and fermentation time on the formation of amino acid nitrogen

3 結(jié)論

在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法，結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析，對(duì)核桃醬油低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步得到了最優(yōu)工藝參數(shù)為:鹽水原料比1.65、發(fā)酵溫度45℃、發(fā)酵時(shí)間6d。在此工藝條件下，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得氨基態(tài)氮含量達(dá)0.835g/100mL，相對(duì)誤差為2.22%。將核桃粕制曲生產(chǎn)核桃醬油，產(chǎn)品保持了核桃的營(yíng)養(yǎng)特性，既拓寬了核桃粕的利用價(jià)值，又為消費(fèi)者提供了新型的健康調(diào)味品。

［1］于海玲，姚永明.發(fā)酵醬油制曲工藝的化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2011，36(4):69－71.

［2］黃持都，魯緋，紀(jì)鳳娣，等 .醬油研究進(jìn)展［J］.中國(guó)釀造，2009，10:7－9.

［3］戴寶合.野生植物資源學(xué)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000:89－90.

［4］王豐俊，王建中，周鴻升，等.核桃產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)進(jìn)展［J］.河北林果研究，2009，24(3):301－304.

［5］史雙枝，李疆，王新剛.核桃蛋白質(zhì)的開發(fā)現(xiàn)狀及前景［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，14(7):93－94.

［6］王豐俊，王希群，李保國(guó)，等.核桃醬油的開發(fā)及市場(chǎng)潛力分析［J］.中國(guó)調(diào)味品，2011，36(5):116－120.

［7］張慶祝，丁曉雯，陳宗道，等 .核桃蛋白質(zhì)研究進(jìn)展［J］.糧食與油脂，2003，5:21－23.

［8］毛曉英，華欲飛，盧偉.核桃蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(9):328－330.

［9］魏鵬飛，馮杰，王棟，等.響應(yīng)面法優(yōu)化醬油生產(chǎn)用大曲培養(yǎng)基［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，30(3):422－426.

［10］藺立杰，趙媛，王建中，等.核桃醬油制曲條件的優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(5):96－100.

［11］林祖申.醬油生產(chǎn)技術(shù)問(wèn)答［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007:69－70.

［12］徐向宏，何明珠 .實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與 Design－Expert、SPSS應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社，2010:154－155.

［13］陳莉，屠康，王海，等.采用響應(yīng)面曲面法對(duì)采后紅富士蘋果熱處理?xiàng)l件的優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(2):159－163.