郭月英，任霆，張靜，李婧，袁倩，程海星，王樂，靳燁*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2. 包頭市東河區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，內(nèi)蒙古包頭市 014000）

巴美肉羊是內(nèi)蒙古巴彥淖爾市廣大畜牧科技人員和農(nóng)牧民經(jīng)過40多年的不懈努力和精心培育而成的肉羊新品種。該品種2007年通過國家畜禽資源委員會審定驗收，正式命名為巴美肉羊，是國內(nèi)第一個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的肉羊雜交育成品種[1-3]。巴美肉羊生長發(fā)育速度較快，產(chǎn)肉性能高。適合舍飼圈養(yǎng)、耐粗飼、采食能力強，適合農(nóng)牧區(qū)舍飼半舍飼飼養(yǎng)。繁殖率較高，性成熟早。搞逆性強、羔羊育肥快，是生產(chǎn)高檔羊肉產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)羔羊[1,2]。近年來，巴美肉羊以其生長及屠宰性能好，肉質(zhì)鮮嫩、無膻味等優(yōu)點深受養(yǎng)殖企業(yè)、加工企業(yè)和消費者的喜愛。

小尾寒羊是我國寶貴的地方優(yōu)良品種，屬于蒙古羊的一個亞系，是世界著名的綿羊多胎品種之一，肉毛兼用。小尾寒羊生長發(fā)育快、早熟、繁殖率高，肉用性能好[4-7]。在1986年出版的《中國綿、山羊品種志》中，小尾寒羊被列為地方優(yōu)良品種。1987年小尾寒羊被納入國家良種基因庫[5]。

生肌決定基因（myogenic determination gene, MyoD）也稱肌肉調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factor ,MRFs），該基因編碼特異的骨骼肌轉(zhuǎn)錄因子[8-9]。目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的生肌調(diào)節(jié)因子有 4種: MyoD、MYOG、Myf5和Myf6，這四個基因共同稱為MyoD基因家族，是影響肉品質(zhì)和產(chǎn)量性狀的關(guān)鍵基因，已經(jīng)被認定為影響肉質(zhì)性狀的候選基因[9-13]。本試驗對 MyoD基因家族的成員之一Myf6 基因多態(tài)性與巴美肉羊、小尾寒羊肉質(zhì)性狀的進行相關(guān)性研究，為Myf6基因?qū)Π兔廊庋?、小尾寒羊肉質(zhì)的影響提供有效理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

試驗用102只巴美肉羊、56只小尾寒羊選至內(nèi)蒙古巴彥淖爾市五原縣巴美肉羊養(yǎng)殖示范基地，試驗個體在相同飼養(yǎng)管理條件下飼養(yǎng)。用5mL EDTA真空采血管頸靜脈采血，干冰帶回，-70℃保存，用于提取全血基因組DNA。

TC-P2A 全自動測色色差計 上海生物生化試驗儀器公司；多孔恒溫水浴鍋 余姚遠東數(shù)控儀器廠；CL-M 嫩度儀 上海精密科學儀器有限公司；PCR儀 Biometra；凝膠成像系統(tǒng) Bio-rad, USA ；Eppendorf 5417R低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf生物公司；BG-power 3500型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京百晶生物技術(shù)有限公司；水平電泳槽 北京百晶生物技術(shù)有限公司；核酸蛋白分析儀 Bio-rad,USA。

Takara Premix Taq ?Version 2.0（Loading dye mix ）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

全血基因組DNA使用天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進行提取。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定濃度，DNA 樣品稀釋至約100 ng/ μL 分裝后于 - 20℃冷凍保存。

1.2.2 肉質(zhì)指標測定

試驗用羊在內(nèi)蒙古漁蒙家食品有限公司進行肉質(zhì)性狀指標測定。

肉質(zhì)指標測定包括pH、肉色（色差 ）、嫩度（剪切力）、眼肌面積。羊胴體沿脊柱左右劈半，左半胴體宰后45 min測pH ，記做pH1，然后在4℃冷庫中懸掛排酸，24 h再次測pH ，記做pH2。取右半胴體的背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌，按參考文獻方法[14-15]，測定肉色、嫩度。

1.2.3 引物合成和PCR 條件

Myf6基因的引物參照NCBI公布的序列，上游引物：5’- GTGTTTCGGATCATTCCAGG-3’，下游引物：5’ - GAGGAAATGCTGTCCACGAT -3’，由北京三博遠志生物技術(shù)有限責任公司合成。

PCR 擴增反應總體積為25μL, 其中Taqmix12.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，滅菌雙蒸水 10.5μL，50 ng/ μLDNA 模板 1μL。

反應條件為：94℃預變性3min，94 ℃變性30s，58℃退火30s，72 ℃延伸30s; 35 個循環(huán), 最后72 ℃ 延伸10min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析

取 2μL PCR 產(chǎn)物，加入 5μL變性緩沖液（98%去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA（pH8.0）、0.025g/100mL 溴酚藍、0.025g/100mL 二甲苯氰）于PCR管中，混勻，在PCR儀中98℃變性10min。迅速取出PCR管，立即插入冰中，放置10min。120V，12% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳5h，銀染顯色。凝膠成像系統(tǒng)( Bio-rad, USA )拍照分析, 判讀基因型。

1.2.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計各種基因型的分布情況,分析巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因不同基因型與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。

2.結(jié)果與分析

2.1 Myf6 基因PCR結(jié)果

PCR擴增巴美肉羊Myf6基因, 所得PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 Myf6 PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of Myf6 gene

由圖1可以看出，擴增得到的片段與目的片段大小一致，為300bp左右，擴增條帶清晰，特異性良好, 可以進行SSCP分析。

2.2 PCR-SSCP 檢測結(jié)果

Myf6基因PCR-SSCP 電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 Myf6基因的SSCP電泳圖Fig.2 PCR-SSCP of the Myf6 gene

對102 只巴美肉羊、56只小尾寒羊Myf6的擴增產(chǎn)物進行PCR-SSCP檢測，結(jié)果如圖2 ，從圖2可以看出,在兩個品種的 Myf6基因擴增片段存在多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)有2種不同基因型，根據(jù)條帶差異，分別命名為AA和AB型。

2.3 等位基因頻率和基因型頻率的統(tǒng)計

巴美肉羊、小尾寒羊Myf6基因的基因型及頻率及等位基因頻率、多態(tài)信息含量如表1、2所示。

表1 Myf6基因在巴美肉羊中的基因型頻率、等位基因頻率和多態(tài)信息含量Table 1 Genotype and allelic frequencies and PIC of Myf6 in Bamei sheep

表2 Myf6基因在小尾寒羊中的基因型頻率、等位基因頻率和多態(tài)信息含量Table 2 Genotype and allelic frequencies and PIC of Myf6 in Small fat- tail sheep

從表1 和表2可以看出，在巴美肉羊、小尾寒羊群體中發(fā)現(xiàn)了AA和AB 兩種基因型，均沒有發(fā)現(xiàn)BB純合子基因型。在巴美肉羊群體中，AA 基因型個體占多數(shù)，在小尾寒羊群體中，AB基因型型個體占多數(shù)，呈偏態(tài)分布。在兩個品種群體中，A等位基因的分布頻率遠高于B，故A等位基因為絕對優(yōu)勢基因。B 等位基因均以雜合子的形式和較小的頻率存在于群體中。多態(tài)信息含量是指在連鎖分析中一個遺傳標記多態(tài)性可提供的信息量的度量。巴美肉羊、小尾寒羊的多態(tài)信息含量分別為0.26和0.34，均屬于中度多態(tài)(PIC > 0. 5為高度多態(tài), 0. 25 < PIC < 0. 5為中度多態(tài), PIC < 0. 25為低度多態(tài))[16]。

2.4. Myf6不同基因型與巴美肉羊肉質(zhì)相關(guān)性的分析

巴美肉羊Myf6的基因型與肉質(zhì)指標的相關(guān)性如表3所示。

表3 Myf6不同基因型對巴美肉羊肉質(zhì)的影響Table 3 Effects of genotypes on meat quality traits in Bamei sheep

由表3可以看出，巴美肉羊AA型與AB間各項肉質(zhì)指標均無顯著性差異，但AA型在背最長肌、股二頭肌處有嫩度優(yōu)于AB型的趨勢，而在股二頭肌處，兩者的嫩度基本沒有差別。AA型的臂三頭肌的紅度值、亮度值均優(yōu)于AB型， AA型的眼肌面積大于AB型。

表4 Myf6不同基因型與小尾寒羊肉質(zhì)的影響Table 4 Effects of genotypes on meat quality traits in Small fat- tail sheep

由表4可知，在背最長肌處，小尾寒羊 Myf6基因的AA型與AB型的的紅度值有顯著性差異（p＜0.05），AA基因型顯著優(yōu)于AB型。其余肉質(zhì)指標無顯著差異，但AA型的背最長肌和臂三頭肌的嫩度有優(yōu)于AB型的趨勢，在紅度值方面，股二頭肌的AA型的紅度值優(yōu)于AB型，但在臂三頭肌處，AB型的紅度值較好。在黃度值方面，AA型的背最長肌處和股二頭肌處的黃度值均次于AB型，但在臂三頭肌處，AA型略優(yōu)于AB型。在小尾寒羊的三個測定肉質(zhì)部位，AA型的亮度值均略好于AB型。兩個基因型在pH1和pH2兩個指標方面基本相同。AA的眼肌面積有大于AB型的趨勢。

由表3 、表4可知, 盡管肉質(zhì)指標無顯著差異, 但從Myf-6 基因的不同基因型個體表現(xiàn)來看,A A總體優(yōu)于AB型，且在試驗群體中Myf-6 基因的A等位基因可以改善羊的眼肌面積。

3.結(jié)論與討論

從實驗結(jié)果可以看出， Myf6 基因?qū)僦卸榷鄳B(tài)性。在檢測的兩個群體中均沒有發(fā)現(xiàn)BB 純合子，B 等位基因以雜合子的形式存在，且頻率較小。Myf6基因?qū)θ赓|(zhì)性狀的影響作用總體不顯著, 但在小尾寒羊的背最長肌處， Myf6基因的AA型與AB型的的紅度值有顯著性差異（p＜0.05），AA基因型肉色顯著優(yōu)于AB型。盡管Myf6 基因的不同基因型對肉質(zhì)指標的影響無顯著差異, 但從Myf6 基因的不同基因型個體表現(xiàn)來看，AA基因型的眼肌面積大于AB基因型。A等位基因可以改善羊的胴體品質(zhì)。另外，在兩個群體的三個肉質(zhì)檢測部位，有AA型優(yōu)于AB型的趨勢。

2008年孫文浩等在對雞的Myf6 基因遺傳多態(tài)性的研究中發(fā)現(xiàn)了3種基因型，AA、AB 和BB型，并推斷Myf6基因的多態(tài)性位點與雞的肌纖維密度和直徑以及部分胴體性狀有一定的相關(guān)性[17]。2005年朱礪等對12個品種豬的Myf6 基因研究中發(fā)現(xiàn)了AA和AB 兩種基因型，并發(fā)現(xiàn)B等位基因有增加實驗群體胴體瘦肉率和眼肌面積, 降低皮脂含量的作用。在該項研究的各個群體中，均未檢測到BB基因型[18]。2006年Kapelanski等在豬的研究中發(fā)現(xiàn)，Myf6 基因在啟動子區(qū)和第一外顯子處的變異均顯著影響滴水損失[19]。

本實驗目前未檢測到BB基因型，因此Myf6 基因是否存在BB基因型及其對羊肉質(zhì)的影響作用還有待進一步擴大試驗樣本后深入研究。

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