孫鵬飛1,2,3,4，高獻(xiàn)禮1,2,3，閆爽1,2,3，陸健1,2,3,4*

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 2141222；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122 4. 宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷 223800）

醬油起源于我國(guó)，是我國(guó)的傳統(tǒng)調(diào)味品，已有2500多年的歷史。近年來，我國(guó)醬油行業(yè)呈現(xiàn)產(chǎn)銷兩旺的景象，醬油年銷售量已經(jīng)突破600萬噸[1]。在此期間，我國(guó)醬油的質(zhì)量也得到了不斷的提高，但醬油二次沉淀問題仍然未得到較好的解決，是困擾我國(guó)醬油行業(yè)發(fā)展的重要質(zhì)量問題[2]。醬油在巴氏殺菌后析出的沉淀稱作一次沉淀，其可通過過濾消除，對(duì)終產(chǎn)品質(zhì)量影響不大。醬油在儲(chǔ)存和銷售過程中瓶底出現(xiàn)的沉淀為二次沉淀[3]，其嚴(yán)重影響我國(guó)醬油的外觀質(zhì)量，特別是與澄清的日本醬油對(duì)比時(shí)，這種外觀問題嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購(gòu)買傾向。目前，日本醬油的價(jià)格是我國(guó)醬油的8～10倍，但仍壟斷了歐美市場(chǎng)并對(duì)國(guó)內(nèi)的高端市場(chǎng)造成了較大沖擊，其中，我國(guó)醬油的二次沉淀問題是導(dǎo)致兩者價(jià)格差異較大和我國(guó)醬油在高端市場(chǎng)缺乏競(jìng)爭(zhēng)力的重要原因之一[4]。

目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者和本實(shí)驗(yàn)的前期工作主要研究了醬油二次沉淀的主要成分、影響其形成的因素及我國(guó)醬油二次沉淀含量的分布[2-6]。日本學(xué)者對(duì)引起醬油二次沉淀的促進(jìn)因子和引起醬油熱凝集作用的酶分別進(jìn)行了分離和鑒定[7-9]。由以上研究可知，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)二次沉淀的研究尚停留在常規(guī)指標(biāo)分析和影響其形成因素的分析上，而對(duì)組成醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的質(zhì)量分布、蛋白質(zhì)來源及蛋白質(zhì)氨基酸組成特征等信息的研究尚未見報(bào)道。

蛋白質(zhì)被認(rèn)為是引起醬油二次沉淀形成的關(guān)鍵因素，而深入了解醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的來源和氨基酸組成特征對(duì)解決醬油二次沉淀問題尤為重要[3-6]。因此本實(shí)驗(yàn)通過N-三(羥甲基)甘氨酸-十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-PAGE）和高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對(duì)醬油二次沉淀中的主要成分蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，并通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）技術(shù)追溯蛋白質(zhì)的來源，以期對(duì)其中蛋白質(zhì)有更深入的認(rèn)識(shí)，為醬油二次沉淀問題的解決提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油 購(gòu)于江蘇無錫華潤(rùn)萬家超市，主要釀造原料為脫脂大豆、小麥、食鹽，高鹽稀態(tài)釀造，氨基酸態(tài)氮≥0.4g/100mL，食品添加劑有焦糖色、谷氨酸鈉、苯甲酸鈉、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、黃原膠，產(chǎn)地北京，生產(chǎn)日期為 2012.5.31；Tricine和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（分子量 4.1 ku-45.0ku） 上海生工生物工程公司；NH4HCO3、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑 均為分析純。

垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Ultraflextreme飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀 德國(guó)Bruker公司；Agilent 1100型氨基酸專用高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QT漩渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；JD-801凝膠成像儀 江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二次沉淀收集 醬油二次沉淀制備方法采用靜置和冷凍干燥法[2-3]，將醬油（500mL，玻璃瓶裝）靜置10d，虹吸法抽去上清，留下最后約20mL醬油和沉淀，搖勻后在4500r/min的條件下離心30min，獲得醬油上清S1以及二次沉淀P1，P1經(jīng)過冷凍干燥3d后便獲得粉狀沉淀P2（收集量約為0.75g/ L）。

1.2.2 醬油上清蛋白質(zhì)收集 將收集過沉淀的醬油上清液S1與20%的三氯乙酸（TCA）溶液1:1混合，在冰浴條件下沉降1h，混合物在10000r/min的條件下離心10min，棄上清，獲得上清蛋白質(zhì)S2。

1.2.3 凝膠電泳分析 將二次沉淀P2和上清蛋白質(zhì)S2復(fù)溶于溶劑中（含8mol/L尿素、1%SDS、1%β-巰基乙醇、0.05mmol/L Tris），在漩渦振蕩器上混合均勻后，10000r/min離心5min，取上清用于電泳。

Tricine-SDS-PAGE分析 由于成品醬油中多肽多在10ku以下[10]，本研究采用了可以分析小于10ku多肽的Tricine-SDS-PAGE凝膠系統(tǒng)，參照曹佐武[11]改良的實(shí)驗(yàn)方法，濃縮膠濃度5%，分離膠濃度16%，陽極緩沖液Tris 12.11g定容至500mL，6mol/L HCl調(diào)pH至8.9，陰極緩沖液Tris 6.06g、Tricine 8.96g、SDS 0.5g定容至500mL，樣品上樣量均為15μL，30V電泳半小時(shí)，100V電泳至結(jié)束。凝膠在含有50%乙醇和10%冰醋酸的固定液中固定半小時(shí)后，在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色3h，然后用含10%甲醇和10%冰醋酸的脫色液脫色至背景清晰，電泳圖譜用JD-801凝膠成像儀記錄，通過捷達(dá)801圖像分析軟件3.3分析。

1.2.4 MALDI-TOF/TOF MS鑒定 將凝膠上蛋白質(zhì)條帶使用自制切點(diǎn)器切下，裝于1.5mL進(jìn)口EP管中，經(jīng)脫色、脫水后用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液經(jīng)抽提濃縮后，在Anchorchip靶板上進(jìn)行點(diǎn)靶，待樣品完全干燥后，將靶板放入儀器 Ultraflextreme MALDI-TOF MS/MS（Bruker）進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，使用肽段標(biāo)準(zhǔn)品（peptidecalibstandard II）進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)結(jié)果使用Bio Tools軟件整合。搜索參數(shù)為：物種屬為全物種；數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI；切割酶為胰酶；允許最大漏切位點(diǎn)為1，Mascot分值大于55即為鑒定成功。

1.2.5 氨基酸分析

1.2.5.1 游離氨基酸測(cè)定

醬油上清S1以及二次沉淀P2用TCA（濃度5%）靜置沉淀1 h后用雙層定性濾紙過濾，濾液經(jīng)10000r/min離心10min，取上清液，利用高效液相色譜法測(cè)定游離氨基酸的含量。采用HYPERSIL OSD色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫40℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)338nm，洗脫流速1.0mL/min。

1.2.5.2 總氨基酸測(cè)定

醬油上清S1以及二次沉淀P2經(jīng)過110℃水解22h，水解液經(jīng)過過濾蒸酸等步驟后用高效液相色譜法測(cè)定氨基酸組成。高效液相色譜測(cè)定條件同游離氨基酸測(cè)定條件。

1.2.5.3 氨基酸疏水性分析

根據(jù)Lozano[12]的經(jīng)驗(yàn)公式考察氨基酸的疏水性：

Xi表示各氨基酸摩爾百分含量，HΦi表示各氨基酸的疏水值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)定3次，取其平均值。運(yùn)用SPSS 11.5 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳分析

圖1為樣品的Tricine-SDS-PAGE圖譜，醬油上清S2主要有兩條條帶c和d，條帶c經(jīng)軟件計(jì)算分子量為22.9ku，經(jīng)積分光密度計(jì)算所占百分比為1.65%，d處條帶連成一片，分子量約從2.0ku至14.0ku，可能是大豆蛋白質(zhì)在醬油釀造過程中被蛋白酶切割成了分子量連續(xù)的多肽，所以電泳條帶出現(xiàn)了連片的情況。條帶d經(jīng)積分光密度計(jì)算，占比例為98.35%，是S2中蛋白質(zhì)的最重要組成部分。醬油沉淀P2主要有兩條條帶a和b，經(jīng)軟件計(jì)算分子量分別約為34.1ku和22.7ku，經(jīng)積分光密度計(jì)算，兩者分別占P2蛋白質(zhì)的19.80%和80.20%。由以上分析可知，S2中主要的蛋白質(zhì)是分子量從2.0ku到14.0ku的多肽；而P2中主要的蛋白質(zhì)是一種分子量約為22.7ku的蛋白質(zhì)，在S2中同樣發(fā)現(xiàn)了一種分子量約為22.9ku的蛋白質(zhì)，兩者是否為同一種蛋白質(zhì)需進(jìn)行MALDI-TOF/TOF MS鑒定 。

圖1 Tricien-SDS-PAGE圖譜Fig. 1 Tricine-SDS-PAGE electrophoresis of the samples

2.2 MALDI-TOF/TOF MS鑒定

為了鑒定沉淀中蛋白質(zhì)的來源及上清蛋白質(zhì)是否與醬油二次沉淀蛋白質(zhì)同源（條帶 b和條帶c），在圖1中取點(diǎn)a、b、c、d進(jìn)行 MALDI-TOF/TOF MS鑒定。條帶a可信度最高的鑒定結(jié)果為大豆球蛋白（Glycinin） G1亞基，Mascot分值155，條帶b和c可信度最高鑒定的結(jié)果為大豆球蛋白（Glycinin） G4亞基，Mascot分值分別為254和76，條帶d未鑒定成功。大豆蛋白質(zhì)主要含有7S和11S兩個(gè)亞基，Glycinin是指11S 球蛋白（Globulin），Glycinin 中目前主要鑒定出的亞基有 G1（A1aB1b）、G2（A2B1a）、G3（A1bB2）、G4（A5A4B3）和G5（A3B4），每個(gè)亞基含有一個(gè)分子量大約在32ku左右的酸性端以及一個(gè)分子量在20ku左右的堿性端[13]。條帶 a的分子量與 Glycinin亞基酸性端相吻合，條帶 b和 c分子量與Glycinin亞基堿性端分子量相吻合。袁德保[14]曾測(cè)定了Glycinin各酸性端與堿性端的疏水性除了在其等電點(diǎn)下，大小依次為A4

醬油在經(jīng)過巴氏消毒過濾等步驟出廠，澄清的醬油在貨架上隨時(shí)間逐步產(chǎn)生沉淀，沉淀并非一步形成的。由圖1以及MALDI-TOF/TOF MS鑒定結(jié)果分析可得，P2中的蛋白質(zhì)b是上清中的蛋白質(zhì)c逐步沉降而來，即上清中的蛋白質(zhì)c是沉淀蛋白質(zhì)的主要來源。P2中蛋白質(zhì)a應(yīng)該也可以在S2中找到，可能因?yàn)槠湓赟2中豐度太低而沒有跑出可見條帶。在圖1中，雖然S2中的主要蛋白質(zhì)都在條帶d中，占了98.35%，但在沉淀P2中幾乎找不到明顯的對(duì)應(yīng)條帶，這說明被蛋白酶切割得到的多肽溶解性較好，不易沉淀。

2.3 氨基酸分析結(jié)果

表1是醬油上清S1和二次沉淀P2的氨基酸組成測(cè)定結(jié)果，蛋白質(zhì)氨基酸定義為總氨基酸減去游離氨基酸[15]（總氨基酸與游離氨基酸未在表中列出）。疏水值一欄數(shù)值越高疏水性越大。

在醬油上清S1和二次沉淀P2中，氨基酸摩爾百分比最高的均為谷氨酸，其次是絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，這與袁德寶[14]測(cè)定的大豆蛋白質(zhì)中各氨基酸含量的趨勢(shì)基本相符。但這幾種氨基酸在S1中所占比例分別比在P2中高45.03%、113.82%、11.98%和25.81%，它們的疏水值均等于小于0.00，是4種親水性氨基酸。而疏水值大于等于1.00的氨基酸在P2中的比例則普遍高于S1，說明二次沉淀蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸比例高。值得注意的是，疏水值較高的脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸在S1中幾乎檢測(cè)不到，而在P2中卻占有一定的比重。根據(jù)Lozano[12]經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算的P2的平均疏水值為0.71，而S2的平均疏水值僅0.33，前者比后者高115.15%，方差分析顯示兩類蛋白質(zhì)的平均疏水值存在顯著性差異（p < 0.05）。上述分析結(jié)果與P2中的蛋白質(zhì)是來源于醬油二次沉淀（不溶性蛋白質(zhì)），S1中的蛋白質(zhì)是來源于醬油上清液（水溶性蛋白質(zhì)）的現(xiàn)象相吻合。同時(shí)也說明大豆蛋白質(zhì)（或多肽）中部分蛋白質(zhì)（或多肽）的高疏水性是導(dǎo)致其形成醬油二次沉淀的重要原因。

表1 氨基酸組成測(cè)定結(jié)果Table 1 Amino acid compostion analysis of sample

3 結(jié)論

通過以上分析，主要得出以下結(jié)論：

3.1 醬油二次沉淀中的蛋白質(zhì)分別是來源于大豆球蛋白質(zhì)G4亞基堿性端B3和G1亞基酸性端A1a，兩者分別占醬油二次沉淀蛋白質(zhì)的80.20%和19.80%。堿性端B3和酸性段A1a是11S大豆球蛋白的重要組成部分，而11S大豆球蛋白是大豆中最重要的蛋白質(zhì)來源。

3.2 醬油二次沉淀蛋白質(zhì)氨基酸組成與醬油上清蛋白質(zhì)相比存在明顯差異，其蛋白質(zhì)平均疏水值顯著高于后者，這是醬油二次沉淀蛋白質(zhì)氨基酸組成的主要特征，也是醬油二次沉淀蛋白質(zhì)形成的重要原因。

因此，如果通過某種方式去除或者降解醬油中Glycinin G4亞基堿性端B3和G1亞基酸性端A1a，可有效解決醬油二次沉淀問題，這需要進(jìn)一步的研究來證實(shí)。

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