宋國(guó)麗，周翠紅，張宇，張小云

靜磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響①

宋國(guó)麗，周翠紅，張宇，張小云

目的研究0.25 T、0.35 T、0.42 T靜磁場(chǎng)持續(xù)或間歇曝磁對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖及骨向分化的影響。方法全骨髓貼壁篩選法分離MSCs，取第三代MSCs采用強(qiáng)度分別為0.25 T、0.35 T、0.42 T靜磁場(chǎng)持續(xù)曝磁或間歇曝磁，CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，并觀察0.35 T連續(xù)曝磁后MSCs堿性磷酸酶活性、骨鈣素含量。結(jié)果細(xì)胞經(jīng)過磁場(chǎng)處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖活力均降低，連續(xù)曝磁第7天效果最為顯著(P＜0.001)，而0.25 T、0.35 T間歇曝磁第2～8天持續(xù)表現(xiàn)出顯著抑制效應(yīng)(P＜0.001)。0.35 T持續(xù)曝磁后，MSCs堿性磷酸酶活性和骨鈣素水平均增高(P＜0.05)。結(jié)論0.25 T、0.35 T、0.42 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁或間歇曝磁均可抑制MSCs增殖，0.35 T連續(xù)曝磁能促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化。

靜磁場(chǎng)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；增殖；骨向分化；大鼠

[本文著錄格式] 宋國(guó)麗，周翠紅，張宇，等.靜磁場(chǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及骨向分化的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2014,20(4):322-326.

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有來源豐富、自我更新能力強(qiáng)和多向分化潛能等生物學(xué)特性，是目前公認(rèn)的組織工程重要的種子細(xì)胞，探索其體外擴(kuò)增及定向分化的條件是目前的研究熱點(diǎn)之一[1-2]。而磁場(chǎng)作為一種外加物理因子，對(duì)組成機(jī)體的各種類型細(xì)胞具有豐富的生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，磁場(chǎng)能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制破骨細(xì)胞功能，促進(jìn)放化療損傷小鼠的造血修復(fù)[3-6]。研究磁場(chǎng)對(duì)MSCs增殖及骨向分化過程中的影響，對(duì)探討影響MSCs體外增殖及骨向分化的物理因素，以及磁場(chǎng)在治療放化療損傷和骨質(zhì)疏松等疾病過程中的具體作用機(jī)制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Dawley大鼠8只，6～8周齡，體重180～240 g，雌雄不限，由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 靜磁場(chǎng) 采用方形和夾層型恒定永磁體，以高斯計(jì)測(cè)量磁體表面各位置磁場(chǎng)強(qiáng)度，磁體經(jīng)75%乙醇消毒后置于培養(yǎng)箱內(nèi)。

1.1.3 試劑 改良型α-MEM培養(yǎng)基、新生牛血清(newborn bovine serum,NBS)、胰蛋白酶(hyclone)；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、青霉素、鏈霉素(SIGMA公司)，Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性檢測(cè)試劑盒(東甌津瑪)；骨鈣素檢測(cè)試劑盒(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所)。

1.2 方法

1.2.1 全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)MSCs 將大鼠引頸脫臼處死后，無菌條件分離股骨和脛骨，分別剪開股骨與脛骨兩端，以含10%NBS的α-MEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，制備骨髓細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾后以改良型α-MEM培養(yǎng)基+10%NBS接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。3 d后全量換液，以后每2～3天全量換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%匯合，0.25%胰酶消化傳代培養(yǎng)。由于不同細(xì)胞的貼壁能力不同，掌握消化時(shí)間，利用差時(shí)消化法，通過傳代，純化并擴(kuò)大培養(yǎng)MSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面標(biāo)志CD45、CD90及CD73的表達(dá)率，并進(jìn)行其脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞分化能力鑒定。連續(xù)傳代3次以后，取P3代的MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞曝磁處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P3代細(xì)胞，以1× 105/ml的濃度接種于96孔板，每孔100μl，設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(沒有經(jīng)過曝磁處理的細(xì)胞懸液)、空白對(duì)照組(等體積的培養(yǎng)基，用于調(diào)零)和曝磁組，各組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

連續(xù)曝磁：磁場(chǎng)組細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板后，置于培養(yǎng)箱中的方形或者夾層型恒定永磁體上，對(duì)照組在另一同樣條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

間歇曝磁：磁場(chǎng)組細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板后，置于培養(yǎng)箱中的方形或者夾層型恒定永磁體上曝磁24 h后取出，脫離磁場(chǎng)培養(yǎng)24 h后重新放進(jìn)磁場(chǎng)中，對(duì)照組在另一同樣條件培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 細(xì)胞曝磁處理1、3、5、7或2、4、6、8 d后，分別進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。每孔加入CCK-8溶液10μl，置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光培養(yǎng)3 h后，震蕩5 min，立即用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上取平均值。

1.2.4 骨髓MSCs成骨性分化分析 將P3代的MSCs以2×105/m1密度接種于預(yù)先置有小蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合后，分為成骨誘導(dǎo)劑組、磁場(chǎng)組、磁場(chǎng)＋誘導(dǎo)劑組和對(duì)照組。成骨誘導(dǎo)液為培養(yǎng)基中加入1×10-7mol/L地塞米松、50 μg/ml抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置0.35 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液。

1.2.5 ALP活性檢測(cè) 誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d、7 d，PBS沖洗細(xì)胞，加入0.25%胰酶37℃消化3～5 min，培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，PBS液洗滌2次，1500 r/min離心5 min，棄上清液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml，加入2%TritonX-100 1 ml，4℃裂解細(xì)胞后，裂解液采用ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性。

1.2.6 骨鈣素含量 誘導(dǎo)培養(yǎng)24 d后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的上清液及加入0.1%的TritonX-100的細(xì)胞裂解液1 ml用于骨鈣素含量的測(cè)定。樣品送中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠MSCs形態(tài)觀察及鑒定

原代培養(yǎng)48 h后可見大量貼壁細(xì)胞，5 d后細(xì)胞形成集落，10 d左右進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，幾次傳代后能得到大量均一的細(xì)胞群。MSCs貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，部分貼壁細(xì)胞呈三角形或多角形，細(xì)胞體積大。傳代后細(xì)胞增殖迅速，3～5 d可形成典型旋渦狀或者輻射狀細(xì)胞集落，集落不斷擴(kuò)大和匯合，細(xì)胞緊密排列，形態(tài)趨于一致，細(xì)胞邊界清晰。隨著傳代次數(shù)的增加，MSCs均一性提高(見圖1)，流式細(xì)胞儀分析其表面抗原：CD45陽性率為10.4%，CD90陽性率為95.7%，CD73陽性率為92%。經(jīng)過定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，證明其具有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞方向分化的能力。

2.2 細(xì)胞增殖活力

0.35 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁在第3天開始即抑制MSCs增殖(P＜0.05)；0.25 T、0.35 T、0.42 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁7 d后MSCs增殖活力均顯著低于對(duì)照組(P＜0.001)。見表1。

圖1 MSCs形態(tài)觀察及鑒定

表1 不同強(qiáng)度靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁對(duì)MSCs增殖活力的影響(OD)

表2 不同強(qiáng)度靜磁場(chǎng)間歇曝磁對(duì)MSCs增殖活力的影響(OD)

表3 0.35 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁3 d和7 d對(duì)MSCsALP活性的影響(U/L)

靜磁場(chǎng)間歇曝磁表現(xiàn)出的效應(yīng)稍有不同，0.25 T和0.35 T靜磁場(chǎng)間歇曝磁均從曝磁第2天開始即表現(xiàn)出對(duì)MSCs增殖的顯著抑制效應(yīng)，這種效應(yīng)一直持續(xù)到第8天(P＜0.001)，而0.42 T靜磁場(chǎng)間歇曝磁對(duì)MSCs增殖無影響。見表2。

2.3 ALP活性

MSCs經(jīng)過0.35 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁和/或誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)3 d后，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)劑組無顯著性差異；磁場(chǎng)＋誘導(dǎo)劑組ALP活性明顯降低(P＜0.01)；而磁場(chǎng)組ALP活性明顯升高(P＜0.01)。誘導(dǎo)7 d后，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)劑組ALP活性升高(P＜0.05)；磁場(chǎng)＋誘導(dǎo)劑組ALP活性降低(P＜0.05)；磁場(chǎng)組ALP活性顯著升高(P＜0.001)。見表3。

2.4 骨鈣素

MSCs經(jīng)過0.35 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁和/或誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)24 d后，誘導(dǎo)劑組、磁場(chǎng)＋誘導(dǎo)劑組和磁場(chǎng)組骨鈣素水平均高于對(duì)照組(P＜0.05)。見表4。

表4 0.35 T靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁24 d后各組細(xì)胞骨鈣素含量(ng/ml)

3 討論

作為再生醫(yī)學(xué)和組織工程中非常有潛力的一種種子細(xì)胞，MSCs的應(yīng)用近年來受到廣泛關(guān)注。如何調(diào)控其向特定方向分化是實(shí)現(xiàn)MSCs有效應(yīng)用的一個(gè)重要問題。已有研究表明對(duì)MSCs外加適當(dāng)?shù)奈锢泶碳と珉姶艌?chǎng)有比較大的潛力。外界物理刺激(如脈沖電磁場(chǎng)、低頻脈沖超聲)已經(jīng)在臨床得到一定的應(yīng)用，如加速新鮮骨折愈合，促進(jìn)有“骨不連”風(fēng)險(xiǎn)的骨折愈合以及促進(jìn)骨組織的自我修復(fù)能力(如在延遲愈合或假關(guān)節(jié)病等病理情況下重新激活愈合過程)[7-9]。這些都有可能是通過電磁波促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖以及MSCs的骨向分化等作用實(shí)現(xiàn)的[10-12]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，特定參數(shù)的恒定磁場(chǎng)可以促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分泌功能、抑制破骨細(xì)胞生長(zhǎng)和破骨功能，從而提高骨密度及骨強(qiáng)度，對(duì)于骨質(zhì)疏松有較好的干預(yù)效果[3-4]；同時(shí)它也對(duì)放化療損傷小鼠具有明顯的保護(hù)作用，促進(jìn)放化療損傷小鼠的造血修復(fù)[5-6]，但是其具體作用機(jī)制目前尚不清楚。骨質(zhì)疏松主要是由于骨重建的失衡所致，即由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收二者脫偶聯(lián)。成骨細(xì)胞由骨髓MSCs分化而來，而破骨細(xì)胞源于造血干細(xì)胞單核-巨噬細(xì)胞前體分支。骨髓MSCs作為骨髓造血微環(huán)境的主要生成細(xì)胞，可以多向分化為造血微環(huán)境的多種組成成分，包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞等，也可以通過分泌多種細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)維持骨髓造血微環(huán)境的穩(wěn)定，促進(jìn)造血干細(xì)胞移植及造血重建[1-2]。因此，骨髓MSCs在骨生成及造血過程中均扮演重要角色，靜磁場(chǎng)可能是通過對(duì)MSCs的直接作用來發(fā)揮其提高骨密度及造血修復(fù)的作用的。

在本實(shí)驗(yàn)中，在0.25 T、0.35 T、0.42 T磁場(chǎng)強(qiáng)度下，連續(xù)曝磁和間歇曝磁均抑制細(xì)胞增殖，但連續(xù)曝磁和間歇曝磁的效應(yīng)不完全相同，這與磁場(chǎng)的“窗口效應(yīng)”是吻合的，某一特定頻率、特定強(qiáng)度范圍的磁場(chǎng)作用方式不同，對(duì)細(xì)胞的影響不同[13]。綜合考慮其效應(yīng)，我們選擇0.35 T磁場(chǎng)連續(xù)曝磁對(duì)細(xì)胞骨向分化過程進(jìn)行干預(yù)。

MSCs誘導(dǎo)至表達(dá)典型的成骨細(xì)胞標(biāo)志的過程是一個(gè)連續(xù)演變的過程，在這一過程中每一個(gè)形態(tài)學(xué)或功能的變化都是受基因控制的。一般認(rèn)為ALP是成熟骨祖細(xì)胞初始表達(dá)的成骨分化早期標(biāo)志，其表達(dá)具有時(shí)間依賴性，一般在第7天達(dá)最高峰，隨后開始減少。骨鈣素，又名骨谷氨酸蛋白，是成骨細(xì)胞分泌的一種非膠原蛋白，在MSCs成骨分化后期表達(dá)量最高，當(dāng)鈣存在時(shí)，骨鈣素可以結(jié)合羥基磷灰石，并穩(wěn)定其構(gòu)象，是成骨細(xì)胞分化成熟的一個(gè)重要指標(biāo)。因此ALP和骨鈣素是反映成骨細(xì)胞分化成為骨細(xì)胞和基質(zhì)鈣化的兩個(gè)重要指標(biāo)[14]。據(jù)報(bào)道靜磁場(chǎng)可以直接刺激成骨細(xì)胞分化成熟，Yamamoto等用0.16 T靜磁場(chǎng)照射3種成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示，從第4天開始磁場(chǎng)組細(xì)胞內(nèi)ALP活性增加，第8～12天達(dá)到高峰；骨鈣素分泌從第8天開始增高，持續(xù)到第20天，且有一定的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系[15]。Huang等采用0.4 T的銣鐵硼永磁體照射人成骨肉瘤細(xì)胞MG63，發(fā)現(xiàn)靜磁場(chǎng)明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞合成以及分泌ALP、骨橋蛋白和I型膠原，因此靜磁場(chǎng)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞早期合成和分泌礦化相關(guān)蛋白，刺激胞外基質(zhì)的合成，分化成熟[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)選擇ALP活性和骨鈣素的表達(dá)作為檢測(cè)指標(biāo)，觀察靜磁場(chǎng)對(duì)MSCs向成骨方向分化的影響。ALP結(jié)果顯示，單純磁場(chǎng)干預(yù)能促進(jìn)MSCs向成骨方向分化，但聯(lián)合誘導(dǎo)劑共同作用后，誘導(dǎo)效果反而沒有單獨(dú)誘導(dǎo)劑作用強(qiáng)。骨鈣素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)組骨鈣素表達(dá)量最高，其次為磁場(chǎng)組和磁場(chǎng)＋誘導(dǎo)組。縱觀ALP和骨鈣素結(jié)果，在成骨誘導(dǎo)早期和后期，磁場(chǎng)的作用基本一致，都表現(xiàn)為單獨(dú)作用時(shí)有促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化的趨勢(shì)，聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用后，效果反而有所下降。因此靜磁場(chǎng)可能通過促進(jìn)rMSCs成骨分化來發(fā)揮其在骨折、骨質(zhì)疏松等骨科疾病中的治療作用。

本研究表明，靜磁場(chǎng)連續(xù)曝磁能夠抑制MSCs增殖，誘導(dǎo)MSCs骨向分化，在調(diào)控MSCs向特定方向分化方面具有比較大的潛力，但與誘導(dǎo)劑聯(lián)合作用未表現(xiàn)出促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞方向分化的效應(yīng)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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Effects of Static Magnetic Field on Proliferation and Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells

SONG Guo-li,ZHOU Cui-hong,ZHANG Yu,et al.College of Life Sciences,Shenzhen University,Shenzhen 518060,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the effect of exposure to 0.25 T,0.35 T,0.42 T static magnetic fields(SMF)on the proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells(MSCs).MethodsPrimary bone marrow MSCs were obtained from Sprague-Dawley rats and screened by adhesive method.MSCs were exposed to 0.25 T,0.35 T,0.42 T SMF continuously and 24 h intermittently respectively. The cell proliferation activity was detected by Cell Counting Kit(CCK-8)assay.The osteogenic differentiation markers including alkaline phosphatase(ALP)activity and osteocalcin were analyzed after continuously exposure to 0.35 T SMF.ResultsCompared with the control group,the proliferation activity of SMF-treated cells significantly decreased,especially on the 7th day(P＜0.001)after continuous exposure, and on the 2nd to 8th day in 0.25 T,0.35 T SMF intermittent exposure groups(P＜0.001).Both the alkaline phosphatase activity and the level of osteocalcin significantly increased in MSCs after continuous exposure to 0.35 T SMF(P＜0.05).ConclusionContinuous or intermittent exposure to 0.25 T,0.35 T and 0.42 T SMF could effectively inhibit the proliferation of MSCs.Continuous exposure to 0.35 T SMF could enhance the osteogenic differentiation of MSCs.

static magnetic field;mesenchymal stem cells;proliferation;osteogenic differentiation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.04.005

R329

A

1006-9771(2014)04-0322-05

2013-11-28

2014-01-17)

深圳市科技研發(fā)資金基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.JC201005280537A)。

深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東深圳市518060。作者簡(jiǎn)介：宋國(guó)麗(1976-)，女，漢族，山東萊陽市人，博士，副教授，主要研究方向：細(xì)胞生物學(xué)。