何志承，楊萬章，向云，王維

低頻電刺激改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能障礙的機制研究①

何志承1，楊萬章2，向云2，王維2

目的探討低頻電刺激(LFS)對腦梗死大鼠神經(jīng)功能和梗死側(cè)腦組織神經(jīng)干細胞(NSC)增殖、血管再生的影響。方法制作大鼠永久性大腦中動脈梗死模型(MCAO)，隨機分為假手術(shù)組、對照組和實驗組，每組又分為7 d和14 d兩個亞組，每個亞組12只。術(shù)后2 d開始進行LFS治療。采用大鼠神經(jīng)功能缺損評分(NSS)評估大鼠神經(jīng)功能缺損程度，運用免疫熒光染色檢測大鼠梗死側(cè)大腦側(cè)腦室的室管膜下層(SVZ)的5-溴尿嘧啶脫氧核糖核苷酸(BrdU)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測大鼠梗死側(cè)大腦的基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量。結(jié)果LFS治療后14 d，實驗組大鼠NSS評分明顯低于對照組和假手術(shù)組(P＜0.01)；LFS治療后各時間點實驗組大鼠梗死側(cè)大腦的SDF-1、BrdU和VEGF水平均較對照組有不同程度的上調(diào)(P＜0.01)。結(jié)論LFS能改善腦梗死大鼠功能障礙，其可能機制是通過激活SDF-1/CXCR4軸，進而發(fā)揮促進NSC增殖和血管再生作用。

低頻電刺激；基質(zhì)細胞衍生因子-1；5-溴尿嘧啶脫氧核糖核苷酸；血管內(nèi)皮生長因子；大鼠

[本文著錄格式] 何志承，楊萬章，向云，等.低頻電刺激改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能障礙的機制研究[J].中國康復(fù)理論與實踐, 2014,20(4):301-305.

腦卒中具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率的特點，給家庭和社會帶來沉重的負擔(dān)。而偏癱是腦卒中患者最常見的后遺癥，急性期發(fā)生率為80%，嚴重影響患者的日常生活活動能力。如何有效恢復(fù)患者的功能障礙，提高患者的日常生活活動能力成為近年來康復(fù)界關(guān)注的重點。低頻電刺激(low frequency stimulation,LFS)不僅具有輸出效應(yīng)而且具有輸入效應(yīng)，一方面通過輸出效應(yīng)誘發(fā)肌肉運動，增加肌力，防止肌肉萎縮；另一方面，通過輸入效應(yīng)提高皮層的興奮性，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重塑[1]。LFS以往多應(yīng)用于慢性腦卒中，近來發(fā)現(xiàn)無論是急性期還是慢性期，LFS都有很確切的臨床療效[2]，但其作用機制至今不明。有報道提示，LFS能促進受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSC)的增殖[3]，從而產(chǎn)生修復(fù)受損神經(jīng)組織的作用[4]，但如何促進NSC增殖及增殖的程度等問題未做深入探討。最近，有研究發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)能促進NSC增殖，而一些康復(fù)治療能上調(diào)腦卒中后SDF-1的水平[5-6]。同時，SDF-1的含量高低與血管再生密切相關(guān)[7]，而神經(jīng)再生和血管再生往往同時發(fā)生，這就促使我們推測LFS可能是通過SDF-1/CXC chemokine receptor 4(CXCR4)軸促進NSC增殖及血管再生，進而改善腦卒中的功能障礙。因此，本研究擬結(jié)合SDF-1/ CXCR4軸探討LFS改善大鼠急性腦卒中后功能障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

雄性Sprague-Dawley大鼠72只，270～300 g，7～9周齡，由廣東省實驗動物中心提供。隨機分為假手術(shù)組、對照組和實驗組，每組又分為7 d和14 d兩個亞組(分別于術(shù)后7 d、14 d處死大鼠)，每個亞組12只。

1.2 模型制作

參照Longa等[8]的方法制永久性大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion)動物模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，沿頸正中線切開皮膚，鈍性分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈近心端及頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈。將直徑為0.26 mm日本進口魚線經(jīng)頸總動脈導(dǎo)入頸內(nèi)動脈，從頸總動脈分叉處進入約20 mm，阻斷左側(cè)大腦中動脈血供。術(shù)后1 d對其進行改良Menzies法評分，出現(xiàn)提尾時右側(cè)前肢屈曲內(nèi)收，向后拖曳尾巴時向右爬行或自主爬行時向右轉(zhuǎn)圈為模型制作成功，具備上述表現(xiàn)之一者隨機編入本實驗對照組或?qū)嶒灲M，假手術(shù)組魚線插入深度為10 mm，不足以阻斷大腦中動脈血供。

1.3 神經(jīng)功能缺損癥狀評分

術(shù)后2 d、7 d、14 d采用神經(jīng)功能缺損評分(Neurological Severity Scores,NSS)[9]評定大鼠神經(jīng)功能受損及恢復(fù)程度。NSS包括運動功能測試、自主運動測試、感覺測試、平衡測試、反射和異常動作測試等部分，能全面反映大鼠神經(jīng)功能狀況，分值越高，癥狀越重；分值越低，神經(jīng)功能恢復(fù)越好。13～18分為重度神經(jīng)功能損傷，7～12分為中度神經(jīng)功能損傷，1～6分為輕度神經(jīng)功能損傷。

1.4 LFS治療

術(shù)后2 d，實驗組大鼠NSS評分后，應(yīng)用LFS治療儀(NeuroTrac?,Continence,Verity Medical公司，英國)經(jīng)皮電刺激大鼠右前肢，對照組大鼠接上LFS治療儀但關(guān)閉電源，假手術(shù)組大鼠不予治療干預(yù)。電流具體參數(shù)[10]：頻率100 Hz，脈寬200 μs，強度3～4 mA，電流通斷比為5 s∶8 s，雙向?qū)ΨQ方波，以產(chǎn)生穩(wěn)定的伸腕伸指動作為宜。每次10 min，每天2次，兩次間隔至少10 min。

1.5 5-溴尿嘧啶脫氧核糖核苷酸(5-bromodeoxy-dine, BrdU)注射及冰凍切片制作

取6只大鼠，處死前3 d腹腔注射BrdU溶液，每天2次，每次間隔至少8 h。BrdU溶液由生理鹽水中加入BrdU粉末(SIGMA公司，B5002)配制而成，濃度為10 mg/ml，按50 mg/kg劑量注射[11]。分別于術(shù)后7 d和14 d，麻醉大鼠后予以心臟灌注。先灌入約150 ml磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L)再灌入約150 ml 4%多聚甲醛(PFA)，直至大鼠全身僵硬后斷頭取腦。腦組織浸于4%PFA 24～48 h后，移至25%蔗糖溶液中直至沉底，冰凍包埋劑包埋。冰凍切片機將腦組織室管膜下層區(qū)(subventricular zone,SVZ)切成30 μm冠狀切片，放入含疊氮化鈉的0.01 mol/L PBS溶液中，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 免疫熒光檢測

將切片置于載有0.01 mol/L PBS的24孔板，復(fù)溫30 min后0.01 mol/L PBS漂洗3次。2 mol/L鹽酸DNA變性(37℃下)20 min后，0.01 mol/L PBS漂洗3次，滴加封閉液即0.3%PBST(0.01 mol/L PBS+0.3%TritonX 100)+0.03 g/ml小牛血清蛋白粉末，搖床孵育1 h。吸干封閉液后加入濃度為1∶200的一抗溶液(綿羊多抗，ABCAM公司Ab1893，用封閉液稀釋)置于搖床30 min后存入4℃冰箱1～2 d。取出切片，復(fù)溫30 min后0.01 mol/L PBS漂洗3次。吸干一抗溶液，滴加二抗溶液(驢抗綿羊，1∶200，Dylight488，ABCAM公司Ab96939，用0.3%PBST稀釋)，避光搖床孵育2 h。0.01 mol/L PBS漂洗3次后貼片，用含DAPI防熒光淬滅液封片，通過激光共聚焦顯微鏡(Leica SP5)拍片統(tǒng)計。觀察部位為大鼠梗死側(cè)大腦的SVZ，每亞組取6只大鼠，每只大鼠隨機抽取5張SVZ腦片。每張切片上選取1個0.15×0.15 mm的固定區(qū)域，用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計該區(qū)域內(nèi)所有陽性細胞(/mm2)。

1.7 ELISA檢測

另外6只大鼠于術(shù)后7 d、14 d處死后斷頭取腦，用0.01 mol/L PBS沖洗腦組織表面多余的血液，稱量腦組織重量后在1 ml 0.01 mol/L PBS中勻漿(低溫下進行)，勻漿液置于≤-20℃環(huán)境過夜。兩個凍-融周期后組織細胞膜破損，將勻漿液放入離心機，4℃下12000 r/min離心5 min后提取上清液，立即檢測或分裝儲存于≤-20℃環(huán)境。樣本檢測操作分別按照SDF-1和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)試劑盒(EIAab公司：E0477r、E0143r)說明書嚴格執(zhí)行。酶標(biāo)儀450 nm處測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本濃度(ng/g或pg/g)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗所得數(shù)據(jù)采用(±s)表示，兩組間比較用t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NSS評分

假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時間點的NSS評分均為0，故不納入統(tǒng)計。術(shù)后2 d、7 d時實驗組與對照組NSS評分均無顯著性差異(P＞0.05)；術(shù)后14 d時，實驗組大鼠NSS評分顯著低于對照組(P＜0.001)。對照組大鼠術(shù)后14 d NSS評分明顯低于術(shù)后2 d、7 d(P＜0.01)；實驗組大鼠NSS評分呈逐漸下降趨勢，術(shù)后各時間點兩兩比較均有非常顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 SDF-1含量

術(shù)后7 d和14 d實驗組大鼠梗死側(cè)大腦SDF-1含量均明顯高于對照組和假手術(shù)組(P＜0.01)，對照組均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。對照組術(shù)后14 d SDF-1含量明顯低于術(shù)后7 d(P＜0.01)，實驗組和假手術(shù)組術(shù)后7 d和14 d之間均無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 SVZ BrdU陽性細胞數(shù)

BrdU免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低倍鏡下大鼠SVZ見明亮綠色的BrdU陽性細胞，呈層狀排列，高倍鏡下BrdU表達于細胞核，呈橢圓形或顆粒狀。假手術(shù)組大鼠SVZ的BrdU陽性細胞分布較稀疏，對照組BrdU陽性細胞數(shù)量較之明顯增多，而實驗組較對照組更加密集。見圖1。

術(shù)后7 d和14 d實驗組大鼠梗死側(cè)SVZ BrdU陽性細胞數(shù)均明顯高于對照組和假手術(shù)組(P＜0.01)，對照組均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。實驗組術(shù)后14 d明顯低于術(shù)后7 d(P＜0.01)，假手術(shù)組和對照組術(shù)后7 d和14 d之間均無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

圖1 各組大鼠SVZ BrdU陽性細胞數(shù)(激光共聚焦，200×)

表1 各組動物術(shù)后各時間點NSS評分

表2 各組大鼠各時間點梗死側(cè)大腦SDF-1含量(ng/g)

表3 各組大鼠各時間點梗死側(cè)大腦SVZ BrdU陽性細胞數(shù)(/mm2)

2.4 VEGF含量

術(shù)后7 d和14 d實驗組大鼠梗死側(cè)大腦VEGF含量均明顯高于對照組和假手術(shù)組(P＜0.01)，對照組均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。實驗組和對照組術(shù)后14 d VEGF含量高于術(shù)后7 d(P＜0.05)，假手術(shù)組術(shù)后7 d和14 d之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表4。

表4 各組大鼠7 d和14 d梗死側(cè)大腦VEGF含量(pg/g)

3 討論

NSC的發(fā)現(xiàn)打破了神經(jīng)細胞不能再生的傳統(tǒng)觀念。腦組織受損后，調(diào)控NSC增殖與分化的微環(huán)境發(fā)生改變，NSC因而被激活并參與受損腦組織的修復(fù)[12]。而受損腦組織的修復(fù)主要體現(xiàn)在神經(jīng)再生和血管再生，已有研究提示兩者之間緊密聯(lián)系：①神經(jīng)前體細胞和血管前體細胞在成人神經(jīng)生發(fā)中心直接相連[13]；②血管能為NSC提供營養(yǎng)支持；③NSC的靶向遷移受血管信號的影響；④神經(jīng)和血管的前體細胞有相同的信號傳導(dǎo)途徑和基因信息通路；⑤NSC上也能表達內(nèi)皮祖細胞特異標(biāo)記。故有“神經(jīng)血管單元”學(xué)說[14]的形成。神經(jīng)血管單元主要由神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和周圍細胞外基質(zhì)構(gòu)成，單元內(nèi)的各種細胞之間、細胞與基質(zhì)之間的相互作用和動態(tài)平衡，筑成調(diào)控NSC的微環(huán)境。

有關(guān)神經(jīng)血管單元形成的研究甚少，SDF-1可能在其形成中起著重要的作用。正常成年動物大腦有低水平的SDF-1、CXCR4表達；腦卒中后，SDF-1在細胞表面整合素激酶、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)的作用下表達釋放增加[15]。SDF-1主要由缺血灶周圍的星形膠質(zhì)細胞釋放[16]，當(dāng)這些星形膠質(zhì)細胞興奮性升高時，SDF-1釋放的量可能會更多。低頻電刺激可能通過其輸入效應(yīng)提高星形膠質(zhì)細胞的興奮性，上調(diào)腦卒中后腦梗死側(cè)SDF-1的水平，進而激活SDF-1/CXCR4軸產(chǎn)生生物效應(yīng)。SDF-1/CXCR4軸能通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶信號通路促進神經(jīng)再生[17]，通過募集血管內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)參與血管網(wǎng)絡(luò)重建，促進血管再生[18]。可見，SDF-1/CXCR4軸既能促進神經(jīng)再生又能促進血管再生，可能在腦卒中后神經(jīng)血管單元的形成中起著重要的作用。

本實驗用NSS法全面評估腦梗死大鼠神經(jīng)功能障礙(包括運動功能、感覺功能和平衡功能等)恢復(fù)的情況，結(jié)果顯示，實驗組NSS評分逐漸下降，術(shù)后各時間點之間均有非常顯著性差異(P＜0.01)，而對照組直到術(shù)后14 d時NSS評分才出現(xiàn)明顯下降(P＜0.01)，說明LFS治療在術(shù)后7 d時已經(jīng)顯示出改善大鼠神經(jīng)功能的作用。術(shù)后7 d時實驗組NSS評分與對照組無顯著性差異(P＞0.05)，術(shù)后14 d時實驗組NSS評分顯著低于對照組(P＜0.01)，提示隨著LFS治療時間的延長療效更明顯，這結(jié)果與向云等研究結(jié)果[19]基本一致。

綜上分析顯示，早期LFS治療對于腦梗死大鼠神經(jīng)功能障礙的恢復(fù)有益。本研究顯示，術(shù)后7 d和14 d實驗組的SDF-1含量均明顯高于對照組(P＜0.01)，實驗組和對照組術(shù)后14 d SDF-1含量均低于術(shù)后7 d，其中，實驗組術(shù)后7 d和14 d之間無顯著性差異(P＞0.05)，而對照組術(shù)后7 d和14 d之間則有非常顯著性差異(P＜0.01)，提示實驗組SDF-1含量一直維持在較高水平，而對照組則有降至低水平的趨勢?？梢姡琇FS治療可能激活了SDF-1/CXCR4軸，推測LFS正是通過這一作用促進腦梗大鼠神經(jīng)功能障礙恢復(fù)。

成年大鼠的神經(jīng)生發(fā)中心為SVZ和海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒下層(subgranular layer, SGL)，故本實驗選取腦梗死側(cè)SVZ作為觀察區(qū)域[20]。BrdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細胞增殖周期的S期可替代胸腺嘧啶嵌入正在復(fù)制的細胞核DNA中，廣泛應(yīng)用于標(biāo)記增殖的細胞，常作為NSC增殖的標(biāo)記物，具有半衰期長、可遺傳到子代細胞的特點[21]。因此，本實驗用BrdU標(biāo)記NSC。本研究的BrdU免疫熒光檢測結(jié)果與Matsumoto等研究結(jié)果[22]相近，假手術(shù)組各時間點均發(fā)現(xiàn)少量BrdU陽性細胞，可見非腦梗死狀態(tài)下大鼠腦內(nèi)亦有少量的NSC存在。術(shù)后7 d和14 d實驗組和對照組BrdU陽性細胞數(shù)均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)。這提示腦梗死是刺激大鼠腦內(nèi)NSC增殖的一個重要因素。術(shù)后7 d和14 d實驗組BrdU陽性細胞數(shù)均明顯高于對照組(P＜0.01)，表明腦梗死雖能刺激大鼠腦部NSC增殖，但增殖的程度并不高，而LFS能促進腦梗死大鼠腦部的NSC的增殖。增殖后的NSC可能轉(zhuǎn)化為星形膠質(zhì)細胞、少突細胞，甚至神經(jīng)元，參與神經(jīng)損傷處神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與功能的重組，修復(fù)受損的腦組織[23]。實驗組術(shù)后14 d BrdU陽性細胞數(shù)明顯低于術(shù)后7 d(P＜0.01)，說明部分增殖的NSC難以存活。本課題對于NSC的分化、遷移及增殖NSC的存活率未作進一步的觀察，將是今后研究的方向。

VEGF被證明是對血管形成有關(guān)鍵特異性作用的生長因子，在啟動腦缺血后血管新生調(diào)控中，起著中心環(huán)節(jié)的作用[24]，故本實驗檢測VEGF以了解腦卒中后大鼠的血管再生情況。本研究顯示，假手術(shù)組術(shù)后7 d和14 d VEGF含量均較低，且無顯著性差異(P＞0.05)。提示非腦梗死大鼠血管再生并不活躍。術(shù)后7 d和14 d對照組和實驗組VEGF含量均高于假手術(shù)組(P＜0.05)，表明腦梗死能刺激大鼠腦部的血管再生。術(shù)后7 d和14 d實驗組VEGF含量均明顯高于對照組(P＜0.01)，這說明LFS能促進腦梗死大鼠缺血側(cè)腦部的血管再生，且血管再生的程度較未接受LFS治療的腦梗死大鼠為高。血管再生能為NSC營造良好的微環(huán)境，使NSC能更好地修復(fù)受損腦組織。本實驗結(jié)果提示，LFS可能通過激活SDF-1/CXCR4軸，促進神經(jīng)和血管再生，營造良好的微環(huán)境，利于腦梗死大鼠受損腦組織的修復(fù)。該通路阻斷的反證研究、SDF-1/CXCR4軸與神經(jīng)血管發(fā)生的相關(guān)性研究等內(nèi)容，我們將在今后的實驗中進行探討。

本研究的結(jié)果顯示，LFS能夠改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能，并能上調(diào)梗死側(cè)腦組織的BrdU陽性細胞數(shù)和VEGF含量，其可能的機制就是通過激活SDF-1/ CXCR4軸，至于有無其他通路激活和神經(jīng)發(fā)生、血管再生的交互關(guān)系值得深入研究。

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Effect of Low Frequency Stimulation on Neural Dysfunction in Rats with Cerebral Infarction

HE Zhi-cheng,YANG Wan-zhang, XIANG Yun,et al.Graduate School,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the effects of low frequency stimulation(LFS)on proliferation and angiogenesis of neural stem cells(NSC)in cerebral infarction side in rats.MethodsThe rats with permanent middle cerebral artery occlusion(MCAO)were randomly divided into sham-operation group,control group and LFS group,each group was divided into 7 days and 14 days subgroups with 12 rats in each subgroup.LFS therapy was started 2 days after operation.The degree of nerve function defect was evaluated with Neurological Severity Score(NSS),and the 5-bromodeoxy-dine(BrdU)positive cells in the subventricular zone(SVZ)of cerebral infarction side were detected with immunofluorescence.Stromal cell-derived factor 1(SDF-1)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in infarction side were detected with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsThe NSS score was lower in the LFS group than in the control group and the sham-operation group 14 days after surgery(P＜0.01).The number of BrdU positive cells,the content of SDF-1 and VEGF in the ischemic side were more in the LFS group than in the other groups(P＜0.01)after treatment.ConclusionLFS can improve the neurological function in rats with acute cerebral infarction,which may associate with activating SDF-1/CXCR4 axis.

low frequency stimulation;stromal cell-derived factor-1;5-bromodeoxy-dine;vascular endothelial growth factor;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.04.001

R743.3

A

1006-9771(2014)04-0301-05

2013-09-29

2013-11-04)

1.深圳市科技計劃項目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(No.201203223)；2.南山區(qū)衛(wèi)生科技計劃項目(No.2011006)。

1.廣州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東廣州市510182；2.深圳市第六人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東深圳市518052。作者簡介：何志承(1987-)，男，廣東廣州市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：楊萬章(1957-)，男，教授，主要研究方向：神經(jīng)干細胞、周圍神經(jīng)康復(fù)。