馬衛(wèi)俊，延慧君，宋新波，劉岱琳，*

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津300162）

根皮苷（Phlorhizin）多存在于蘋果屬的多種植物（蘋果，杜梨，海棠等）中，在根、莖、葉和果實(shí)中均有分布[1]。根皮苷是一種二氫查耳酮苷類化合物[2]，也是蘋果中的特征酚類物質(zhì)[3-4]，由于具有良好抗氧化[5]、防治糖尿病及其并發(fā)癥[6-8]、抗癌、美白[9]作用，因而引起人們的廣泛關(guān)注。根皮苷不僅具有上述功能，同時(shí)也是一種甜度較高的天然非糖甜味劑，其甜度是葡萄糖的300倍[10]，對(duì)于甜食愛好者和糖尿病人是一種理想的糖類替代品[11]，并且具有低毒的特點(diǎn)[12]。因此在新型藥物和功能性食品的開發(fā)中其已經(jīng)成為重要的一種功能性成分[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾并獲得結(jié)構(gòu)新穎的化合物[13]。因此本文分別用24種真菌對(duì)根皮苷進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，采用RP-HPLC分析結(jié)果，篩選出了對(duì)根皮苷具有轉(zhuǎn)化作用的菌種，同時(shí)計(jì)算根皮苷底物的消耗率。其研究結(jié)果將確定能對(duì)根皮苷實(shí)現(xiàn)微生物轉(zhuǎn)化的菌種，為后續(xù)利用微生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)根皮苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，為功能食品的研發(fā)提供更具價(jià)值的先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98%）：天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；根皮苷試藥（純度為90%）：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；無水乙醇（分析純）、乙腈（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；純凈水：娃哈哈飲料有限公司；24種菌種：中科院微生物菌種庫。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FA1204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；島津高效液相色譜儀（包括LC-20AT雙泵、SPDM20A UV檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱）：日本島津公司；phenomenexLunaC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相 A 相：冰醋酸 ∶水=1∶99（V/V），B 相：乙腈 ∶水 ∶冰醋酸=70 ∶29.8 ∶0.2（V/V/V），進(jìn)行梯度洗脫：0（0%B）-20（25%B）-50（35%B）-80（60%B）-85 min（0%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：280 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取根皮苷對(duì)照品，加色譜甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.984 0 mg/mL的母液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 根皮苷的微生物轉(zhuǎn)化與分析樣品的制備[14]

把保存在固體斜面培養(yǎng)基中的24種真菌分別接種到200 mL液體土豆培養(yǎng)基中，每種真菌設(shè)置空白組和給藥組，于全溫振蕩器中在160 r/min，28℃條件下培養(yǎng)48 h后，給藥組加入6 mL的根皮苷（質(zhì)量濃度為10 mg/mL）無水乙醇溶液，空白組加入6 mL的無水乙醇試劑。繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)96 h后，將轉(zhuǎn)化液分別超聲20 min，過濾，濾液用等體積的正丁醇萃取3次，萃取液濃縮至干，甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，即得到該菌的給藥樣品溶液和空白樣品溶液，待測(cè)。

1.3.4 對(duì)根皮苷具有轉(zhuǎn)化作用的菌種篩選[15]

根據(jù)“1.3.1”色譜條件，每種真菌的給藥樣品溶液和空白樣品溶液進(jìn)樣20 μL，把每種真菌的給藥組、空白組圖譜及根皮苷的標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行對(duì)比，分析給藥組除根皮苷峰外是否比空白組多出明顯的峰，從24種真菌中篩選出對(duì)根皮苷有轉(zhuǎn)化作用的真菌。

對(duì)有轉(zhuǎn)化作用的3種真菌進(jìn)行消耗率的測(cè)定：將已形成孢子的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌生理鹽水10 mL，刮菌苔，用無菌四層紗布過濾，用力振蕩濾液1 min，制成孢子懸液。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板對(duì)種子液計(jì)數(shù)得到孢子數(shù)數(shù)量級(jí)均為104CFU/mL，由此可知，3種真菌孢子懸液濃度近似一致，具有可比性。分別將此濃度的三種真菌孢子懸液1 mL接入到液體土豆培養(yǎng)基中，其后處理同“1.3.3”。

2 結(jié)果與分析

2.1 根皮苷含量測(cè)定結(jié)果[16-18]

2.1.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取“1.3.2”中的對(duì)照品溶液 20 μL，注入液相色譜儀，按“1.3.1”下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖1。

圖1 根皮苷的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Phlorizin

根皮苷的保留時(shí)間為57.95 min。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。按“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品峰面積Y/mV為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X/（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得根皮苷回歸方程為：Y=4×107X+44 514（R2=0.999），結(jié)果表明在0.098 40 mg/mL～0.787 2 mg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

取上述根皮苷對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，測(cè)得各次峰面積的RSD為1.02%。結(jié)果表明，此分析方法精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品，按樣品溶液測(cè)定方法操作，分別在 0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)行測(cè)定，其 RSD 為 1.71%，結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性良好。

2.2 根皮苷微生物轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.2.1 對(duì)根皮苷具有轉(zhuǎn)化作用的菌種篩選結(jié)果

根據(jù)“1.3.1”色譜條件，每種真菌的給藥樣品溶液和空白樣品溶液進(jìn)樣20 μL，把每種真菌的給藥組、空白組圖譜及根皮苷的標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行對(duì)比，分析給藥組除根皮苷峰外是否比空白組多出明顯的峰，經(jīng)分析從24種真菌中篩選出了3種對(duì)根皮苷有轉(zhuǎn)化作用的真菌，即 AS3.739、AS3.2875、AS3.3450。3 種真菌除根皮苷峰外比空白都多出了明顯的峰。這3種真菌的轉(zhuǎn)化率測(cè)定的HPLC圖譜見圖2。

圖2 3種真菌對(duì)根皮苷轉(zhuǎn)化的液相圖Fig.2 HPLC of biotransformation of Phlorizin by three kinds of fungi

2.2.2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的轉(zhuǎn)化后樣品，按“1.3.6”方法制備供試溶液，精密吸取同一供試品溶液3份，每份0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，分別加入0.1、0.08、0.05 mL根皮苷對(duì)照品溶液，按“1.3.2”色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)量峰面積，計(jì)算測(cè)得量及其回收率，結(jié)果見表1。

表1 根皮苷的加樣回收率Table 1 Results of Phlorizin recovery

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的處理方法對(duì)根皮苷具有較高的回收率。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照“2.1”的色譜條件，分別對(duì)有轉(zhuǎn)化作用的菌種AS3.739、AS3.2875、AS3.3450 的加藥樣品進(jìn)行液相分析，每種真菌平行操作6份，測(cè)得這3種真菌的剩余根皮苷峰面積的RSD值分別為0.21%、2.29%、1.21%。

2.2.4 培養(yǎng)基中根皮苷回收率的測(cè)定

3組液體土豆培養(yǎng)基中分別加入6 mL根皮苷（質(zhì)量濃度為10 mg/mL）無水乙醇溶液，按照樣品的制備方法培養(yǎng)，萃取真空濃縮干燥，用色譜甲醇溶解定容至25 mL。各取適量用0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL，測(cè)得根皮苷的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出根皮苷的含量。根皮苷的回收率=根皮苷質(zhì)量（mg）/60 mg×100%，結(jié)果見表 2。

表2 培養(yǎng)基中根皮苷的回收率Table 2 The loss of Phlorizin in medium（n=3）

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)方法對(duì)根皮苷具有較高的回收率，符合菌種篩選的要求。

2.2.5 根皮苷消耗率的測(cè)定

從有轉(zhuǎn)化的3種真菌的給藥組供試液中各取適量，在“1.3.1色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)得根皮苷平均峰面積（n=3），根據(jù)回歸方程求得剩余的根皮苷，算出消耗率。消耗率=（加藥量-剩余量/回收率）/加藥量×100%，結(jié)果見表3。

表3 消耗率結(jié)果Table 3 The results of consumption rate

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所篩選的菌種對(duì)根皮苷有一定的消耗作用，但是要獲得該菌種生物轉(zhuǎn)化根皮苷的最佳條件，有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)，最后得出有3種真菌（AS3.739、AS3.2875、AS3.3450）對(duì)根皮苷有轉(zhuǎn)化作用，為進(jìn)一步深入研究其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。當(dāng)液體培養(yǎng)基中底物濃度為0.3 mg/mL時(shí)，利用RP-HPLC法測(cè)定了3種真菌對(duì)根皮苷的消耗率分別為45.31%，59.01%，55.60%。本文建立的檢測(cè)方法簡便快速，使根皮苷的進(jìn)樣量在0.098 40 mg/mL～0.787 2 mg/mL內(nèi)，峰面積和進(jìn)樣量之間線性關(guān)系良好。

RP-HPLC法能確定溶液中的物質(zhì)，并能準(zhǔn)確的測(cè)定其含量，且和TLC法相比，靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為根皮苷微生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

對(duì)比空白組和轉(zhuǎn)化組HPLC圖譜，轉(zhuǎn)化組除了根皮苷和轉(zhuǎn)化點(diǎn)的峰外，其它峰和空白組存在一定差異，其原因可能是加入的根皮苷對(duì)真菌的生長產(chǎn)生一些影響，所以會(huì)從圖譜中看出一些差異。

同時(shí)，培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)化時(shí)間、底物加入量等對(duì)微生物轉(zhuǎn)化的影響也是很大的，這些因素不僅影響消耗率，還可能對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類有所影響。在后續(xù)的研究過程中，本課題組將深入研究根皮苷的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化條件，以期獲得該菌株生物轉(zhuǎn)化根皮苷的最佳條件。

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