梁 衛(wèi) 龔 林 王冠宇 張麗玲 陳 曄

（中國(guó)人民解放軍第四五四醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

清熱化瘀滋陰方對(duì)狼瘡性MRL/lpr小鼠免疫功能的影響*

梁 衛(wèi) 龔 林△王冠宇 張麗玲 陳 曄

（中國(guó)人民解放軍第四五四醫(yī)院，江蘇 南京 210002）

目的 觀察中藥清熱化瘀滋陰方對(duì)狼瘡性MRL/lpr小鼠免疫功能的影響。方法選用 C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組，將MRL/lpr小鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組（清熱化瘀滋陰方組）、西藥組（潑尼松組）、中西藥結(jié)合組（清熱化瘀滋陰方加潑尼松組），每組各8只。對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，其余各組連續(xù)灌胃給予相應(yīng)藥物4周，4周末熒光顯微鏡觀察腎組織IgG的沉積，測(cè)定血清IgG、抗ds-DNA抗體、IL-6、IL-10、ICAM-1的含量。結(jié)果與模型組比較，中藥組、西藥組、中西藥結(jié)合組MRL/lpr小鼠腎組織IgG熒光強(qiáng)度顯著降低、血清IgG、抗ds-DNA抗體、IL-6、IL-10、ICAM-1的含量下調(diào)，其中以中西藥結(jié)合組效果更為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論清熱化瘀滋陰方具有改善狼瘡性MRL/lpr小鼠免疫功能的作用。

清熱化瘀滋陰方 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 免疫功能

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種多因素參與的多臟器多系統(tǒng)損害并伴有多種免疫學(xué)異常的自身免疫性疾病，其發(fā)病與免疫系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)。SLE患者體內(nèi)存在免疫球蛋白、自身抗體、多種細(xì)胞因子表達(dá)異常。筆者采用清熱化瘀滋陰方配合激素治療SLE患者，療效較好。為進(jìn)一步觀察該方對(duì)免疫系統(tǒng)的影響，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，以探討該方的作用機(jī)理。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物 C57BL/6J小鼠由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2002-0053；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)SCXK（蘇）2002-0012。MRL/lpr小鼠由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK-（軍）2007-004。

1.2 試藥與儀器 清熱化瘀滋陰方由南京中醫(yī)藥大學(xué)提供（批號(hào)100510，100726）；潑尼松由南京白敬宇制藥有限公司生產(chǎn) （國(guó)藥準(zhǔn)字 H32022566，批號(hào)061203）；IgG、抗ds-DNA抗體、IL-6、ICAM-1、IL-10檢測(cè)試劑盒均由上海藍(lán)基生物有限公司提供；酶標(biāo)儀購(gòu)自北京艾普生物設(shè)備有限公司；離心機(jī)購(gòu)自北京醫(yī)用離心機(jī)廠；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。

1.3 分組與給藥 正常對(duì)照組選用C57BL/6J小鼠8只。取MRL/lpr小鼠32只，雌性，8周齡，飼養(yǎng)至90 d，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成4組，每組8只。模型組給予蒸餾水；中藥組給予清熱化瘀滋陰方（45.6 g/kg）；西藥組給予潑尼松（10 mg/kg）；中西藥結(jié)合組給予清熱化瘀滋陰方（45.6 g/kg）和潑尼松（10 mg/kg）。給藥體積0.1 mL/10 g，連續(xù)灌胃4周。于第4周末，所有小鼠禁食12 h后，稱質(zhì)量，眼球取血，離心取血清，處死取腎組織。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè) （1）腎組織熒光免疫組化IgG的檢測(cè)。小鼠處死后，取腎組織，4％多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。迅速取出腎臟并固定。按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟及水合，PBS浸泡5 min，洗滌3次。將切片置于枸櫞酸三鈉與枸櫞酸按3∶4比例配成的溶液中，微波中高火8 min。冷卻，PBS浸泡5 min，洗滌3次。3％H2O2-甲醇溶液處理切片15 min，滅活酶。PBS浸泡5 min，洗滌3次。加熒光標(biāo)記FITC-羊抗小鼠 IgG （1∶200）100 μL，37℃，孵育1 h。PBS浸泡5 min，洗滌3次。DAPI染色，室溫避光10 min。PBS浸泡5 min，洗滌3次。封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照，綠色熒光為細(xì)胞內(nèi)FITC的陽(yáng)性標(biāo)記。（2）血清IgG、抗ds-DNA抗體、IL-6、IL-10、ICAM-1指標(biāo)檢測(cè)。分組方法同前，給藥4周后，小鼠眼球取血，離心取血清，ELISA法測(cè)定血清IgG、抗dsDNA抗體、IL-6、IL-10、ICAM-1的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎組織IgG沉積比較 見(jiàn)表1。正常對(duì)照組IgG陰性。模型組IgG熒光染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，熒光陽(yáng)性面積范圍較大。中藥組、西藥組IgG熒光強(qiáng)度較弱，熒光陽(yáng)性面積較模型組顯著減少（P＜0.05），中西藥結(jié)合組熒光強(qiáng)度呈微弱陽(yáng)性，IgG熒光面積顯著減少 （P＜ 0.01）。中藥組、西藥組、中西藥結(jié)合組IgG在腎臟的沉積均減少。見(jiàn)圖1。

表1 各組血清IgG、抗ds-DNA抗體、腎組織IgG沉淀的比較（±s）

表1 各組血清IgG、抗ds-DNA抗體、腎組織IgG沉淀的比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n正常對(duì)照組 8模型組 8中藥組 8西藥組 8中西藥結(jié)合組 8 IgG（μg/mL）13.47±1.51**34.78±8.72 21.13±2.57*18.57±3.47*15.94±2.46*抗dsDNA抗體（pg/mL）IgG陽(yáng)性面積百分比（％）258.71±30.41** 0 469.37±78.62 41.51±6.471 326.58±45.47* 28.97±3.608*294.08±48.54* 26.88±2.976*280.18±35.57** 21.57±3.357**

圖1 各組MRL/lpr狼瘡小鼠腎組織IgG沉積的比較（IF，×400）

2.2 各組MRL/lpr狼瘡小鼠血清IgG、抗ds-DNA抗體、腎組織IgG沉淀的比較 見(jiàn)表1。中藥組、西藥組、中西藥結(jié)合組MRL/lpr狼瘡小鼠血清IgG、抗dsDNA抗體水平均顯著低于模型組（P＜0.05），提示清熱化瘀滋陰方可明顯降低血清IgG、抗ds-DNA抗體水平，改善免疫功能。

2.3 各組血清IL-6、IL-10、ICAM-1含量的比較 見(jiàn)表2。中藥組、西藥組、中西藥結(jié)合組IL-6、IL-10、ICAM-1顯著低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），中西藥結(jié)合組血清IL-6、ICAM-1水平又明顯低于中藥組和西藥組（P＜0.05，P＜0.01），提示清熱化瘀滋陰方可明顯降低血清IL-6、IL-10、ICAM-1的含量，下調(diào)細(xì)胞因子水平。

表2 各組血清IL-6、IL-10、ICAM-1含量的影響（±s）

表2 各組血清IL-6、IL-10、ICAM-1含量的影響（±s）

與中西藥結(jié)合組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 n正常組 8模型組 8中藥組 8西藥組 8中西藥結(jié)合組 8 IL-6（pg/mL）87.03±11.35**146.19±22.15 115.43±20.66*△113.65±13.11*△90.03±12.35**IL-10（pg/mL）ICAM-1（ng/mL）79.30±15.10** 0.82±0.12**183.88±54.90 2.13±0.73 99.27±18.00* 1.44±0.23*△△91.49±14.66* 1.38±0.33*△△81.29±15.50** 0.84±0.19**

3 討論

SLE是一種全身性多器官的自身免疫病，目前尚無(wú)特效療法。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病由于先天稟賦不足、肝腎陰虧，加之七情內(nèi)傷、勞倦過(guò)度、飲食內(nèi)傷、六淫侵襲、日光曝曬，致使邪毒乘虛而入，熱毒灼熾，耗傷津液，血脈瘀阻，初起侵襲肌表血脈筋骨，進(jìn)而內(nèi)侵臟腑。初期主要病機(jī)是熱熾、血瘀、陰虧。根據(jù)這一特點(diǎn)，筆者用清熱化瘀滋陰方清熱涼血、解毒散瘀以治其標(biāo)，養(yǎng)陰扶正以顧護(hù)陰液而治其本。方中以水牛角、白花蛇舌草瀉火解毒、涼血止血為君藥；金銀花、連翹清熱解毒并透邪熱，生地黃、麥冬清熱涼血、養(yǎng)陰生津，赤芍、牡丹皮、紫草涼血活血、散瘀化斑，青風(fēng)藤活血通絡(luò)止痛，共為臣藥；白術(shù)健脾化濕，顧護(hù)中焦脾胃，為佐藥；生甘草清熱解毒、健脾和中、調(diào)和諸藥，為使藥。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)清熱化瘀滋陰方能明顯改善發(fā)熱、雷諾現(xiàn)象、脫發(fā)、口干、女性月經(jīng)不調(diào)等癥狀，具有顯著降低患者ESR、IgG、ANA、抗ds-DNA抗體及升高補(bǔ)體C3、WBC、RBC、PLT的作用［1］。

免疫調(diào)節(jié)障礙是SLE發(fā)病的重要因素之一。CD4+T輔助細(xì)胞（Th）在SLE發(fā)病過(guò)程中起重要作用。Th細(xì)胞分為Th1和Th2兩種功能性亞群，SLE中存在Th1／Th2細(xì)胞因子譜偏移，Th1型細(xì)胞因子如IL-2、TNF-α等，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10等。SLE患者體內(nèi)Th2型細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，特別IL-6、IL-10能刺激B細(xì)胞殖和分化，導(dǎo)致B細(xì)胞功能亢進(jìn)，促進(jìn)分泌免疫球蛋白，產(chǎn)生自身抗體［2］。細(xì)胞黏附分子是指一類調(diào)節(jié)細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合，起黏附作用的膜表面糖蛋白。ICMA-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞粘附相應(yīng)的受體之一，主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞和各種白細(xì)胞表面，可以介導(dǎo)炎癥細(xì)胞參與多臟器組織的損害過(guò)程。SLE患者組織及血液中的淋巴細(xì)胞ICAM-1呈高表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)［3］。SLE發(fā)病還與多種自身抗體密切相關(guān)，抗ds-DNA抗體是SLE的特異性標(biāo)志。從活動(dòng)性狼瘡性腎炎患者腎小球?yàn)V液中分離出的抗ds-DNA抗體，可以誘導(dǎo)正?；驀?yán)重免疫缺陷的小鼠出現(xiàn)腎炎［3］。

本研究探討清熱化瘀滋陰方對(duì)MRL/lpr小鼠免疫功能的影響。結(jié)果顯示，清熱化瘀滋陰方能顯著降低MRL/lpr小鼠腎組織IgG熒光強(qiáng)度，下調(diào)血清IgG、抗ds-DNA抗體、IL-6、IL-10、ICAM-1的含量。研究還發(fā)現(xiàn)，清熱化瘀滋陰方配合激素治療效果優(yōu)于單用激素組或中藥組，中西藥聯(lián)合治療療效更好。清熱化瘀滋陰方通過(guò)有效抑制狼瘡性MRL/lpr小鼠免疫紊亂，調(diào)節(jié)免疫功能，發(fā)揮治療SLE的作用，可能是該方治療SLE的作用機(jī)制之一，其更多的作用機(jī)制尚待今后進(jìn)一步研究。

［1］梁衛(wèi)，張麗玲，鞠敏.清熱化瘀滋陰方對(duì)狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞凋亡及臨床指標(biāo)的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2010，19（1）：41-42.

［2］梁鳴，李幼姬，陽(yáng)曉，等.中藥狼瘡方對(duì)狼瘡樣小鼠外周血IL-6和IL-10水平的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2001，2（9）：502-504.

［3］周文俊，袁立新，朱奮勇.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清可溶性細(xì)胞間黏附分子-1、L-選擇素及細(xì)胞因子濃度測(cè)定的臨床意義［J］.淮海醫(yī)藥，2008，26（3）：225-226.

［4］章海濤.系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2006，15（1）：66-76.

The Effect of Qingrehuayuziyin Decoction on Immune Function of MRL/lpr Lupus Rats

LIANG Wei，GONG Ling，WANG Guan-yu，et al.No.454 Hospital of PLA，Jiangsu，Nanjing 210002，China

Objective：To study on the impact of Qingrehuayuziyin Decoction on immunity of MRL/lpr lupus rats. M ethods：C57BL/6J rats were selected to establish control group.MRL/lpr lupus rats were divided randomly into model group，Chinese medicine group（Qingrehuayuziyin Decoction），western medicine group（prednisone），Chinese and western medicine combination group（Qingrehuayuziyin+prednisone）.Each group included eight mice. The control group and model group were given saline.Other groups were given corresponding medicine by gavage for four weeks.Four weeks later，deposition of IgG in renal tissue was observed by fluorescence microscope.Levels of IgG，anti-ds-DNA antibody，IL-6，IL-10，ICAM-1 in serum were measured.Result：Compared with model group，IgG fluorescence intensity in renal tissue of MRL/lpr lupus rats was revealed.Levels of IgG，anti-ds-DNA antibody，IL-6，IL-10，and ICAM-1 in serum were significantly decreased in Chinese medicine group，western medicine group，in group Chinese and the westerm medicine combination group.The differences were of statistical significance（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion：Qingrehuayuziyin Decoction can effectively improve immune function of MRL/lpr lupus rats.

Qingrehuayuziyin Decoction；Systemic lupus erythematosus；Immune function

R285.5

B

1004-745X（2014）04-0600-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.015

南京軍區(qū)科技創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目（10MA054）

△通信作者

2013-12-20）