陳集敏，謝霆，陳新忠

(1.海南省人民醫(yī)院病理科，海南海口 570311；2.海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南海口 570311；3.華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院心臟外科，湖北武漢 430022)

·臨床病理·

脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性瓣膜中的表達特點

陳集敏1，謝霆2，陳新忠3

(1.海南省人民醫(yī)院病理科，海南?？?570311；2.海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南?？?570311；3.華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院心臟外科，湖北武漢 430022)

目的探討脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性主動脈瓣的組織表達特點。方法收集2012年10月至2013年10月在海南省人民醫(yī)院心外科因退行性主動脈瓣疾病行手術切除的主動脈瓣標本30例[男17例，女13例，年齡(55±6)歲]，因夾層動脈瘤行Bentall手術切除正常主動脈瓣標本7例[男性4例，女性3例，年齡(41±8)歲]。經(jīng)HE和免疫組織化學染色，觀察退行性主動脈瓣的組織病理學改變，了解脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素在退行性主動脈瓣的表達特點。結果HE染色顯示，與正常瓣膜比較，損傷的主動脈層內皮下可見大量炎癥細胞聚集、纖維組織增生和結節(jié)性鈣化灶形成，退行性主動脈瓣的厚度不同程度增加[重度(2.80±1.18)mm、中度(2.10±0.09)mm、輕度(0.92±0.13)mm、正常(0.75±0.07)mm]，進一步的分析顯示膠原層增厚明顯，松質層厚度降低，而心室層無明顯改變，免疫組織化學染色顯示脂聯(lián)素在正常瓣膜和退行性主動脈瓣中無表達；瘦素在正常瓣膜無表達，而在退行性主動脈瓣見新生血管以及血管周圍有表達。結論退行性主動脈瓣病變中瘦素表達增加。

退行性主動脈瓣病變；脂肪因子；脂聯(lián)素；瘦素

近年研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織不僅是一個能量儲存器官，而且是一個具有內分泌功能的組織，它可以分泌多種調控機體代謝和能量平衡的活性因子，包括瘦素、腫瘤壞死因子、纖溶酶原激活物抑制劑、抵抗素、白介素、脂聯(lián)素等。其中瘦素是最早發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，瘦素能調節(jié)體重和促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌的具有類似膠原結構的蛋白，被認為是胰島素抵抗和動脈粥樣硬化的保護性因子[1]。目前研究認為退行性主動脈瓣疾病的病理機制類似于主動脈粥樣硬化[2]，雖然證實脂肪因子參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，但目前尚不清楚脂肪因子脂聯(lián)素、瘦素是否參與退行性主動脈瓣的病理過程。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年10月至2013年10月在我院因退行性主動脈瓣疾病行手術切除的主動脈瓣(病變瓣膜組)標本30例[男性17例，女性13例，年齡(55±6)歲]，因夾層動脈瘤行Bentall手術切除的正常主動脈瓣(正常瓣膜作為對照組)標本7例[男性4例，女性3例，年齡(41±8)歲]。排除標準：甲狀旁腺疾病和腎功能衰竭等影響鈣磷代謝以及炎癥所致C反應蛋白和血沉升高的患者。所有組織標本均經(jīng)患者及家屬知情同意后采集，研究方案獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法本實驗隨機選取3個正常瓣膜和10個異常的瓣膜，在中部進行測量，所有標本選取最大直徑進行測量，每一例標本分別測量心室層、松質層、膠原層厚度及瓣膜總厚度。正常瓣膜為一組，異常瓣膜按照瓣膜增厚呈度分為低、中、高三組，對這四組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，比較各組瓣膜不同層的差異。

1.2.1 主動脈瓣膜的制片與觀察標本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片。為了更好地保存抗原，在切片前標本不行脫鈣處理。常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察瓣膜的厚度、組織結構、細胞的組成、鈣化的部位以及鈣化周圍的改變。

1.2.2 免疫組織化學染色兔抗人脂聯(lián)素及瘦素多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司，按1:200稀釋，采用PV-9000通用型二步法試劑盒。具體操作按試劑盒說明操作，結果判讀以出現(xiàn)棕黃色且高出背景色為陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS19.0版本統(tǒng)計軟件處理和分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，兩兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 瓣膜組織肉眼觀察正常的瓣膜呈半透明狀，柔韌性好。病變的瓣膜可見不同程度的鈣化，表現(xiàn)為瓣口的狹窄和瓣膜明顯增厚、質硬。

2.2 HE染色結果與正常瓣膜比較[(0.75± 0.07)mm]，損傷的主動脈層內皮下可見大量炎癥細胞聚集、纖維組織增生和結節(jié)性鈣化灶形成，退行性主動脈瓣的厚度不同程度增加[重度(2.80±1.18)mm，中度(2.10±0.09)mm，輕度(0.92±0.13)mm]，重度、中度、輕度瓣膜狹窄患者分別與正常瓣膜厚度比較，重度瓣膜狹窄t值=22.60、P＜0.001(雙側)；中度瓣膜狹窄t值= 11.77、P＜0.001(雙側)；輕度瓣膜狹窄t值=3.13、P= 0.017(雙側)，其差異均具有統(tǒng)計學意義，進一步的分析顯示膠原層增厚明顯，松質層厚度降低，而心室層無明顯改變，見表1。

表1 正常瓣膜和退行性主動脈瓣組織厚度比較(mm，±s)

表1 正常瓣膜和退行性主動脈瓣組織厚度比較(mm，±s)

瓣膜心室層松質層膠原層瓣膜正常(n=3)輕度增厚(n=3)中度增厚(n=3)重度增厚(n=4) 0.20±0.09 0.18±0.06 0.21±0.07 0.19±0.08 0.31±0.12 0.27±0.10 0.11±0.06 0.01±0.01 0.24±0.12 0.27±0.09 0.89±0.12 1.34±0.15 0.75±0.07 0.92±0.13 2.10±0.09 2.80±1.18

2.3 脂聯(lián)素或瘦素表達特點免疫組織化學染色顯示，脂聯(lián)素在正常瓣膜和退行性主動脈瓣中無表達；瘦素在正常瓣膜無表達，而在退行性主動脈瓣見新生血管以及血管周圍有表達，見圖1。

圖1 正常和病變瓣膜脂聯(lián)素和瘦素免疫組織化學染色

3 討論

正常瓣膜主要由5層構成，依次為瓣膜主動脈面的內皮層、富含膠原纖維的膠原層、致密基質較少并排列疏松的間質細胞構成的松質層、有明顯彈力纖維的心室層、瓣膜心室面的內皮層。正常的瓣膜中纖維排列整齊，無血管、炎性細胞浸潤[3]，退行性主動脈瓣較正常瓣膜增厚，損傷的主動脈瓣內皮下可見大量炎癥細胞聚集，血管生成，在炎癥細胞下方可見結節(jié)性鈣化灶存在，由于炎癥細胞浸潤和鈣化結節(jié)的擠壓效應導致鈣化下面的松質層消失，而炎癥細胞刺激纖維增生導致病變瓣膜纖維增厚紊亂。

目前對退行性主動脈瓣疾病的研究顯示，其致病機制類似于主動脈粥樣硬化，在血流動力學沖擊下瓣膜正常的結構受到破壞，導致主動脈瓣內皮層以及膠原纖維損傷、血脂積聚、炎性細胞浸潤、泡沫細胞和血管生成，最終瓣膜鈣化[2]。但目前脂肪因子和退行性主動脈瓣鈣化之間的研究較少，尚不清楚脂肪因子是否參與了退行性主動脈瓣病變。既往脂肪組織被認為是一個無效的身體車廂，只作為儲存能量。近年來越來越多的數(shù)據(jù)表明，脂肪組織是重要的內分泌和旁分泌器官，能夠產(chǎn)生多種酶、激素和生長因子(統(tǒng)稱為脂肪因子)。研究表明，脂肪因子除了調節(jié)影響葡萄糖、脂肪代謝，還與肥胖和代謝性疾病有關，如脂肪代謝異常密切相關的動脈粥樣硬化，目前呈幾何級增長的文獻顯示，脂肪因子影響了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，調節(jié)血管中內皮細胞、平滑肌細胞、泡沫細胞、炎癥細胞的活性[1，4]。

脂聯(lián)素是經(jīng)典的脂肪因子，在動物試驗中通過藥理或遺傳方法升高血漿脂聯(lián)素，能夠減輕肥胖誘導的血管內皮功能障礙與高血壓，還可以防止動脈粥樣硬化、心肌梗塞和糖尿病性心肌病。此外，脂聯(lián)素是保護心血管健康的血管擴張劑，在心臟和血管細胞起抗凋亡，抗炎和抗氧化活性[5]，而本實驗退行性主動脈瓣并未發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素表達，且在正常瓣膜中也未見表達，這提示動脈粥樣硬化可能與鈣化性主動脈瓣存在不同的機制。

血液中脂肪因子瘦素升高是心肌梗死的危險因子[6]，它與動脈粥樣斑塊里的C反應蛋白和可溶性IL-6受體正相關[7]。動物實驗觀察到瘦素導致血管平滑肌細胞增生和基質金屬蛋白酶2產(chǎn)生，在動脈粥樣硬化晚期促進粥樣斑塊的破裂[8-10]；瘦素還可以促纖維化細胞因子分泌進而導致血管生成[11]，增加人和小鼠巨噬細胞分泌促動脈粥樣硬化的脂蛋白脂肪酶[12]，加劇血小板聚集[13]，誘導內皮細胞C反應蛋白表達[14]。在現(xiàn)有的研究中認為瘦素促進了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。本實驗病理標本檢查發(fā)現(xiàn)，在正常瓣膜未見瘦素表達，而鈣化瓣膜出現(xiàn)瘦素的表達，表明瘦素參與了瓣膜鈣化的發(fā)生發(fā)展，同時實驗也發(fā)現(xiàn)瘦素主要在新生血管以及血管周圍表達，提示退行性主動脈瓣中的瘦素可能來源于血液中。

本實驗研究表明，特定的脂肪因子與退行性瓣膜病變發(fā)生發(fā)展密切相關，為了解退行性瓣膜病變的機制研究提供了新的視角，也為以后的診斷治療提供了可能的理論依據(jù)。

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Expression characteristics of adiponectin and leptin in degenerative valve.

CHEN Ji-min1,XIE Ting2,CHEN Xin-zhong3.1.Department of Pathology,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2. Department of Cardiac Surgery,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;3.Department of Cardiac Surgery,Union Hospital Affiliated to Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of adiponectin and leptin in degenerative aortic valve. MethodsThe aortic valve specimens from October 2012 to October 2013 were collected in cardiac surgery department of People's Hospital of Hainan Provincial,which included 30 cases of specimens removed from degenerative aortic valve disease[17 cases of males,13 cases of females,aged(55±6)years old]and 7 cases of normal aortic valve specimens with dissecting aneurysm underwent Bentall operation resection[4 cases of males,3 cases of females,aged(41±8)years old]. And then the histopathological changes of degenerative aortic valve were observed by HE and immunohistochemical staining to study the expression characteristics of adiponectin and leptin.ResultsBy HE staining,compared with the normal valve,collection of amount of inflammatory cells,fibrous tissue hyperplasia and nodular calcification in injury endothelium of aortic layer were noted,and the thickness of degenerative aortic valve increased in varying degrees[severe (2.80±1.18)mm,moderate(2.10±0.09)mm,mild(0.92±0.13)mm,normal(0.75±0.07)mm].Further analysis showed a increase in the thickness of collagen layer,and a decrease in the thickness of trabecular layer,with no obvious change in the ventricular layer.By immunohistochemical staining,there was no expression of adiponectin in normal and degenerative aortic valve and no expression of leptin in normal valve,but the expression of leptin could be observed in and around new vessels of the degenerative aortic valve.ConclusionThe expression of leptin increases in degenerative aortic valve.

Degenerative aortic valve disease;Adipokines;Adiponectin;Leptin

R36

C

1003—6350(2014)16—2455—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0958

2014-04-04)

國家自然科學基金（編號：81270265）；海南省衛(wèi)生廳基金（編號：2012-07）

謝霆。E-mail：masterxieting@hotmail.com