洪良利，秦杰升，黃杰雄，邱前程，董恒

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科1、耳鼻喉頭頸外科2，廣東汕頭515041)

·臨床病理·

NF-κB p65、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及意義

洪良利1，秦杰升2，黃杰雄1，邱前程1，董恒1

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科1、耳鼻喉頭頸外科2，廣東汕頭515041)

目的探討NF-κBp65、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及意義。方法采用免疫組化EnVision兩步法檢測257例PTC及癌旁甲狀腺組織中的NF-κBp65、CyclinD1表達水平，并分析二者表達水平的變化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果(1)NF-κBp65、CyclinD1在PTC組織中的陽性率分別為58.8%(151/257)及89.9%(231/257)，均顯著高于癌旁正常甲狀腺組織(P＜0.01)；(2)NF-κBp65、CyclinD1的表達水平與腫瘤大小、病灶數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，與性別及年齡無關(guān)；(3)NF-κBp65與CyclinD1的表達呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。結(jié)論NF-κBp65、CyclinD1的異常表達與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預后有密切聯(lián)系，聯(lián)合檢測二者表達水平可作為判斷PTC生物學行為及預后指標，并為其新靶點治療提供依據(jù)。

NF-κB p65；CyclinD1；甲狀腺乳頭狀癌

甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，占甲狀腺惡性腫瘤的70%～85%[1]。大多數(shù)PTC經(jīng)手術(shù)切除及放射性131I的治療，預后良好，但由于PTC早期即易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，而現(xiàn)有對PTC預后的臨床評分指標(包括性別、甲狀腺功能、腫物大小、多灶性、血管、甲狀腺外組織侵犯等)均不能精確判斷出生物學行為上具有較高侵襲性及轉(zhuǎn)移能力的PTC，所以對PTC的發(fā)病機制和生物學行為的研究顯得尤為重要。核因子-κB p65 (NF-κBp65)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，是細胞多種信號轉(zhuǎn)導途徑的匯聚點，激活后可與相關(guān)基因啟動子或增強子特殊DNA序列(κB位點)結(jié)合，通過調(diào)控其下游靶基因如細胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1等的表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。

本研究采用免疫組織化學法檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常甲狀腺組織中NF-κBp65和CyclinD1的表達，探討它們在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用及兩者間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2007年6月至2013年6月經(jīng)手術(shù)切除的257例甲狀腺乳頭狀癌及對應(yīng)癌旁正常甲狀腺組織存檔蠟塊，每例臨床資料完整。其中男性57例，女性200例。年齡17～79歲，中位年齡44歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫制劑等抗癌治療。

1.2 試劑本實驗中所用一抗NF-κ B p65 (sc-8008)購自美國Santa Cruz公司，實驗抗體使用濃度為1:100；CyclinD1均購自福建邁新公司，為即用型工作濃度。二抗及DAB顯色試劑均購自福州邁新公司。

1.3免疫組化染色及結(jié)果判斷標準采用En-Vision二步法，由試劑公司提供陽性對照片，分別以乳腺癌、套細胞淋巴瘤組織作為NF-κB p65、CyclinD1的陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，操作嚴格按照試劑說明書進行。NF-κB p65染色結(jié)果以胞漿和(或)胞核棕黃染色者為陽性細胞，無棕黃染色者為陰性；CyclinD1以胞核棕黃染色者為陽性細胞。參照Francesco等的判定標準[3]：0分，無陽性著色；1分，陽性細胞＜10%；2分，陽性細胞介于10%～50%；3分，陽性細胞數(shù)＞50%；根據(jù)染色程度分為:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項結(jié)果相加：總分＜2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行分析，組間率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。檢驗標準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NF-κBp65、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常甲狀腺組織中的表達NF-κBp65在PTC組織中出現(xiàn)胞漿表達增強，其中151例(59%)出現(xiàn)少量胞核/核周異位陽性表達，在癌旁正常甲狀腺組織濾泡上皮中僅表現(xiàn)為胞漿弱陽性(見圖1)，未見核陽性表達；CyclinD1在PTC組織中231例(90%)出現(xiàn)核陽性過表達，在癌旁正常甲狀腺組織中未檢測到表達或個別病例出現(xiàn)低表達(陽性細胞＜5%)，見圖2。

圖1 NF-κB p65在癌旁正常甲狀腺組織表現(xiàn)為胞膜/胞漿弱陽性，在甲狀腺乳頭狀癌組織中細胞漿表達增強伴少量胞核/核周異位陽性表達(EnVision二步法，200倍)

2.2 癌組織中NF-κB p65、CyclinD1表達與PTC臨床病理學參數(shù)的關(guān)系NF-κB p65、CyclinD1的異常高表達率在PTC組織中的表達水平與腫瘤大小、病灶數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高病理分期有關(guān)，但與性別及年齡無關(guān)(P＞0.05)。直徑大于1 cm的癌表達率高于直徑小于1 cm的微小癌；多發(fā)病灶組高于單發(fā)病灶組；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無轉(zhuǎn)移組；高臨床病理分期(Ⅲ～Ⅳ期)組高于低臨床病理分期組(Ⅰ～Ⅱ期)，見表1。

圖2 CyclinD1在PTC中彌漫核強陽性，癌旁正常甲狀腺組織未見表達(EnVision二步法，200倍)

表1 NF-κB p65、CyclinD1表達與PTC臨床病理學參數(shù)的關(guān)系

2.3 甲狀腺乳頭狀癌中NF-κB p65的表達與CyclinD1之間的相互關(guān)系NF-κBp65的表達與CyclinD1陽性表達之間呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。在151例NF-κBp65陽性標本中，有142例同時存在CyclinD1過表達；而在28例CyclinD1陰性標本中有19例伴NF-κBp65表達缺失，相關(guān)分析證實，甲狀腺乳頭狀癌組織中NF-κBp65與CyclinD1表達呈正相關(guān)(r=0.412，P＜0.01)，見表2。

表2 甲狀腺乳頭狀癌中NF-κB p65的表達與CyclinD1之間的相互關(guān)系(例)

3 討論

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65是哺乳動物組織中一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在刺激因素作用下，胞漿中的NF-κ Bp65被激活，逆移入核后與相關(guān)基因啟動子或增強子特殊DNA序列(κB位點)結(jié)合，促進下游靶基因蛋白的表達，參與多種惡性腫瘤細胞如白血病、淋巴瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等的細胞增殖，抗凋亡、促血管生成及轉(zhuǎn)移作用[2，4-6]。體外細胞學研究表明，在甲狀腺乳頭狀癌、濾泡癌和未分化癌細胞株中存在NF-κB活化水平的升高，并且與甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。也有研究表明甲狀腺乳頭狀癌組織中存在NF-κB的激活，但卻沒有探討其臨床病理意義[3，6]。在本研究中，NF-κB p65在PTC細胞漿中的表達較癌旁正常甲狀腺組織明顯增強58.8%(151/257)病例出現(xiàn)少量核或核周表達。NF-κB p65陽性表達與腫瘤大小、病灶數(shù)目、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高臨床病理分期有關(guān)。因此提示，NF-κBp65的異常激活在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中均起了一定作用。

細胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1是細胞周期的正性調(diào)控因子，目前認為是一種原癌基因，其過表達可縮短G1期，加快細胞進入S期，促進腫瘤細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，CyclinD1在PTC組織中陽性率高達90%，與腫瘤大小、病灶數(shù)目、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高臨床病理分期呈正相關(guān)，而與年齡及性別無關(guān)。提示CyclinD1的異常過表達同樣不僅參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預后密切相關(guān)。

CyclinD1同時作為NF-κB p65的重要靶基因，其啟動子上含有兩個與NF-kB結(jié)合的位點，NF-κB的活化可導致CyclinD1過表達，與腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究中，151例NF-κBp65陽性PTC中CyclinD1有82例過表達，NF-κBp65與CyclinD1的表達成正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。推測NF-κBp65的激活可能通過調(diào)控下游CyclinD1的過度表達，參與PTC的細胞增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移，但其確切機制有待進一步探討。

綜上所述，NF-κBp65的激活及CyclinD1的過表達在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展侵襲及轉(zhuǎn)移中起了一定作用，提示NF-κBp65可能作為PTC治療新靶點。臨床病理診斷中對手術(shù)切除PTC組織及術(shù)前甲狀腺腫物細針穿刺組織進行NF-κBp65、CyclinD1的檢測，可以作為早期診斷甲狀腺乳頭狀癌、幫助判斷甲狀腺乳頭狀癌患者是否需要進行頸部淋巴結(jié)清掃及判斷PTC患者預后的指標，并且為新靶點治療提供依據(jù)。

[1]Zidan J,Karen D,Stein M,et al.Pure versus follicular variant of papillary thyroid carcinoma:clinical features,prognostic factors, treatment and survival[J].Cancer,2003,97(5):1181-1185.

[2]Hinz M,Kappmann D,Eichten A,et al.NF-kappa B function in growthcontrol:regulationofcyclinD1expressionandGO/ GI-to-S-phase transition[J].Mol Cell Biol,1999,19(4):2690-2698.

[3]Starenki DV1,Namba H,Saenko VA,et al.Induction of thyroid cancer cell apoptosis by a novel nuclear factor kappaB inhibitor,dehydroxymethylepoxyquinomicin[J].Clin Cancer Res,2004,10(20): 6821-6829.

[4]Prasad S,Ravindran J,Aggarwal BB.NF-κB and cancer:how intimate is this relationship[J].Mol Cell Biochem,2010,336(1-2): 25-37.

[5]Pacifico F,Mauro C,Barone C,et al.Oncogenic and Anti-apoptotic Activity of NF-Kappa B in Human Thyroid Carcinomas[J].Biol Chem,2004,279(52):54610-54619.

[6]Bauerle KT,Schweppe RE,Haugen BR.Inhibition of nuclear factor-kappa B differentially affects thyroid cancer cell growth,apoptosis,and invasion[J].Mol Cancer,2010,9:117.

Expression of NF-kB p65,CyclinD1 in papillary thyroid carcinoma and its significance.

HONG Liang-li1,QIN Jie-sheng2,HUANG Jie-xiong1,QIU Qian-cheng1，DONG Heng1.
Department of Pathology1,Depertment of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery2,The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041,Guangdong,CHINA

>ObjectiveTo investigate the expression of nuclear factor kappaB(NF-kB)p65 and CyclinD1 in papillary thyroid adenocarcinoma(PTC)and its clinical significance.MethodsWe investigated the expression of NF-kB p65,CyclinD1 in 257 cases of papillary thyroid adenocarcinoma and normal thyroid tissues by immunohistochemical technique.Results(1)The expression of NF-kB p65 and CyclinD1 in PTC is significantly higher than that in the normal thyroid tissues(P＜0.01).(2)The aberrant expression rates of NF-kB p65 and CyclinD1 in PTC were closely related to tumor size,numbers of lesion,lymph node metastasis and clinicopathological stage but did not show correlation with age and gender.(3)There was a significant positive correlation between NF-kB p65 and CyclinD1(P＜0.01).ConclusionNF-kB p65 and CyclinD1 may play roles in the occurrence and development of PTC.It is possible to use a joint test of NF-kB p65 and CyclinD1 in identifying the disease and providing a prognosis.

NF-kB p65;CyclinD1;Thyroid papillary;Adenocarcinoma

R736.1

A

1003—6350（2014）12—1853—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.12.0721

2014-01-24)

洪良利。E-mail：hong_liangli@163.com