管頻，陳娟，馮光球，吳潔

(1.海南省人民醫(yī)院醫(yī)療保健中心四區(qū)，海南?？?570311；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199)

·論著·

COPD患者肺組織中Smad蛋白、TGF-β1表達(dá)與氣道重塑的關(guān)系

管頻1，陳娟1，馮光球1，吳潔2

(1.海南省人民醫(yī)院醫(yī)療保健中心四區(qū)，海南?？?570311；2.海南醫(yī)學(xué)院，海南?？?571199)

目的觀察COPD患者肺組織中Smad蛋白、TGF-β1的表達(dá)及與氣道重塑的相關(guān)性。方法標(biāo)本取自48例因肺部孤立性結(jié)節(jié)行肺葉切除術(shù)患者的肺組織，按術(shù)前肺功能分為非COPD組(A組，24例)及COPD組(B組，24例)。所取肺組織HE染色后光鏡下觀察肺組織的病理形態(tài)學(xué)改變，以半定量圖像分析法測(cè)量小氣道管壁和平滑肌層厚度。用Western blot法檢測(cè)肺組織中Smad2、Smad3、Smad7及TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果(1)B組Smad2、Smad3及TGF-β1表達(dá)均高于A組，Smad7的表達(dá)均高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，且Smad2、Smad3蛋白與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)(均P＜0.05)，而Smad7蛋白與TGF-β1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；(2)肺組織Smad2、Smad3、TGF-β1的表達(dá)與單位長(zhǎng)度的管壁面積(WAt/Pi，μm2/μm)及單位長(zhǎng)度的平滑肌層面積(WAsm/Pi，μ m2/μm)表達(dá)均呈正相關(guān)(均P＜0.05)；Smad7蛋白與單位長(zhǎng)度的管壁面積(WAt/Pi，μm2/μm)及單位長(zhǎng)度的平滑肌層面積(WAsm/Pi，μm2/μm)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(均P＜0.05)。結(jié)論在COPD肺組織氣道重塑中，TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是關(guān)鍵，其中Smad3、Smad2發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而Smad7表現(xiàn)出抑制作用。

慢性阻塞性肺疾?。粴獾乐厮?；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；Smad蛋白

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的病理基礎(chǔ)為氣道壁和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥及結(jié)構(gòu)的破壞，最終導(dǎo)致了管腔狹窄、肺氣腫形成和進(jìn)行性氣流受限，而這一個(gè)過程則稱之為氣道重塑。氣道重塑是COPD氣流受限的主要病理基礎(chǔ)，是COPD病變呈持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素[1-2]。在眾多炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)是同時(shí)具有重要的免疫調(diào)節(jié)和致纖維化活性，故而在氣道炎癥及氣道重塑中占重要地位[3]。Smads蛋白是TGF-β超家族表達(dá)細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控的分子，可將TGF-β超家族信號(hào)由I型受體傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮他們重要的生物學(xué)活性。Smad3通路在調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的ECM積聚過程中有十分重要的地位[4]。本文檢測(cè)COPD組患者外周肺組織TGF-β1、Smad3的表達(dá)，從支氣管形態(tài)學(xué)測(cè)等方面評(píng)價(jià)氣道重塑，同時(shí)了解TGF-β1、Smad3的表達(dá)的關(guān)系以及與氣道重塑指標(biāo)的相關(guān)性，探討TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在COPD氣道重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1 取材標(biāo)本取自于2011年4～11月期間因發(fā)現(xiàn)肺部孤立性結(jié)節(jié)于我院胸外科住院擬行肺葉切除術(shù)的48例患者(入選患者近6周內(nèi)無急性加重)。實(shí)驗(yàn)所需的肺組織取遠(yuǎn)離肺癌病灶5 cm以上、無腫瘤浸潤的外周肺組織。按術(shù)前一周的肺功能結(jié)果分為非COPD組(24例)及COPD組(24例)。COPD的診斷符合慢性阻塞性肺疾病診治指南[1]。兩組患者的年齡、性別等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；颊呔庀忍煨孕呐K病、左心疾病、COPD以外的其他肺疾病以及全身其他系統(tǒng)慢性病變。

1.2 標(biāo)本采集及HE染色處理手術(shù)取下肺組織標(biāo)本，迅速用10%福爾馬林充分浸泡固定12 h，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋。取上述人肺組織石蠟塊，切片(5 μm)、HE染色后光鏡下觀察其病理形態(tài)學(xué)改變。

1.3 支氣管形態(tài)學(xué)測(cè)量方法隨機(jī)選取HE切片中內(nèi)周長(zhǎng)＜2 mm、長(zhǎng)徑/短徑≤2較規(guī)整的小支氣管，每個(gè)標(biāo)本選3～6個(gè)支氣管橫截面積，采用META MORPH圖像分析系統(tǒng)(美國Universal Imaging Corporation)進(jìn)行以下測(cè)量：管壁總面積(WAt)=氣道外壁所圍面積(Ao)-管壁內(nèi)側(cè)的面積(Ai)，平滑肌層面積(WAsm)=平滑肌層外側(cè)面積(Asmo)-平滑肌層內(nèi)側(cè)面積(Asmi)，然后以管壁內(nèi)周長(zhǎng)(Pi)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以單位長(zhǎng)度的管壁面積(WAt/Pi，μm2/μm)表示管壁厚度，同樣以單位長(zhǎng)度的平滑肌層面積(WAsm/Pi，μm2/μm)表示平滑肌層厚度[5]。

1.4 Western blot法檢測(cè)外周氣道肺組織Smad蛋白、TGF-β1蛋白質(zhì)表達(dá)采用Western blot法檢測(cè)外周氣道肺組織的Smad3(分子量48 kD)、Smad2 (分子量52 kD)、Smad7(分子量46 kD)、TGF-β1(分子量12.5 kD)的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參蛋白(分子量36 kD)。應(yīng)用RIPA蛋白裂解液從肺組織中提取蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后于-80℃保存。取蛋白樣品加等體積的2×電泳樣品緩沖液加熱變性后，以20 μg蛋白/泳道上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜。予麗春紅S染色確定轉(zhuǎn)膜情況并標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)參照物位置。用5%脫脂奶粉封閉后，先后加入一抗(Smad3、Smad2抗體、Smad7抗體或TGF-β1抗體)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，DAB顯色劑顯色，結(jié)果：陽性區(qū)域顯深棕色。拍攝濾膜照片，并掃描灰度值，Smad2/GAPDH、Smad 3/GAPDH、Smad7/ GAPDH、TGF-β1/GAPDH吸光度比值來表示，見圖1。

圖1 免疫印跡法：兩組肺組織Smad蛋白、TGF-β1的表達(dá)

2 結(jié)果

2.1 受試者的一般情況及肺功能資料兩組受試者性別、年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組支氣管形態(tài)學(xué)測(cè)量結(jié)果見表1。COPD組管壁厚度、平滑肌厚度均明顯高于非COPD組(P＜0.05)。

表1 兩組受試者一般資料及病理學(xué)資料比較()

表1 兩組受試者一般資料及病理學(xué)資料比較()

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2.2 兩組所取外周肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的表達(dá)比較COPD組TGF-β1和Smad2、Smad3的表達(dá)均高于非COPD組(P＜0.05)，但Smad7的表達(dá)低于非COPD組(P＜0.05)，見表2。

表2 兩組TGF-β1、Smad蛋白的表達(dá)差異比較(，kD)

表2 兩組TGF-β1、Smad蛋白的表達(dá)差異比較(，kD)

2.3 相關(guān)分析外周肺組織TGF-β1表達(dá)與Smad2、Smad3的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.737、0.496，P＜0.000)，與Smad7的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.547，P＜0.000)。TGF-β1與管壁厚度(WAt/Pi)、平滑肌厚度(WAsm/Pi)呈正相關(guān)(r值分別為0.744、0.711，P＜0.000)，但Smad7的表達(dá)與二者均呈負(fù)相關(guān)(r值分別為0.576、0.483，P＜0.000)。Smad2、Smad3的表達(dá)與管壁厚度(WAt/Pi)均呈正相關(guān)(r值分別為0.673、0.528，P＜0.000)，Smad2、Smad 3的表達(dá)與平滑肌厚度(WAsm/Pi)均呈正相關(guān)(r值分別為0.683、0.481，P＜0.000)。

3 討論

COPD是肺組織對(duì)于有害顆?；驓怏w產(chǎn)生的異常炎性免疫反應(yīng)相關(guān)的復(fù)雜綜合征，大量的實(shí)質(zhì)、炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與了COPD的發(fā)生和發(fā)展過程[6]。TGF-β1是一種多效性細(xì)胞因子，參與包括COPD在內(nèi)的多種肺疾病的發(fā)病機(jī)制，其升高不僅僅早于肺功能異常及病理形態(tài)異常，且與疾病嚴(yán)重呈正相關(guān)[7]，本文的結(jié)果也再次驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

TGF-β1在細(xì)胞外基質(zhì)活化后通過Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)著如例如Th2、Th17的功能，特別是Treg (調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)及成纖維細(xì)胞來促進(jìn)炎癥反應(yīng)、合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及促進(jìn)膠原沉積等[3]，從而引起氣道修復(fù)、重塑，也就是說，TGF-β1/Smad是氣道重塑這個(gè)過程的關(guān)鍵[8]。Smads蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同分為三類：第一類為受體調(diào)節(jié)型Smads蛋白，包括Smadl、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8；第二類為通用調(diào)節(jié)型Smads蛋白即Smad4；第三類是抑制型Smads蛋白，包括Smad6和Smad7[9]。研究證實(shí)TGF-β1主要通過TGF-β1/Smads途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，活性的TGF-β1結(jié)合并激活Ⅱ型/I型TGF-β1受體，活化的受體進(jìn)一步激活Smads家族中的Smad3和Smad2，然后其聚集成共同復(fù)合物或形成數(shù)個(gè)異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特異的DNA連接蛋白結(jié)合，直接啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，從而引起氣道壁細(xì)胞外基質(zhì)沉積和血管的平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化等一系列變化[10-11]。

在研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，COPD組患者肺組織TGF-β和Smad2、Smad3的表達(dá)均明顯高于非COPD組，而Smad7的表達(dá)卻低于非COPD組，而且TGF-β和Smad3、2的表達(dá)與氣道壁厚度、氣道平滑肌厚度等呈正相關(guān)，而Smad7與二者呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明COPD氣道重塑程度中TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中Smad3、Smad2發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用，而Smad7表現(xiàn)出抑制作用。TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中Smad蛋白家族可能是改善COPD氣道重塑的重要治療靶點(diǎn)。

[1]柳濤,蔡伯薔.慢性阻塞性肺疾病診斷、處理和預(yù)防全球策略(GOLD2011年修訂版)介紹[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2012, 11(1):1-12.

[2]Decramer M,Janssens W,Miravitlles M.Chronicobstructive pulmonary disease[J].Lancet,2012,379(9823):1341-1351.

[3]Yang YC,Zhang N,Van Crombruggen K,et al.Transforming growth factor-beta1 in inflammatory airway disease:a key for understanding inflammation and remodeling[J].Allergy,2012,67 (10):1193-1202.

[4]周語平,楊成林.理肺化纖方對(duì)肺纖維化大鼠的防治作用及對(duì)TGF-βl/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011,17(12):151-155.

[5]武紅莉,馮淬靈,武維屏.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道炎癥與重塑的實(shí)驗(yàn)研究[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào),2006,20(2):95-98.

[6]Yao H,de Boer WI,Rahman I.Targeting lung inflammation:novel therapies for the treatment of COPD[J].Curr Respir Med Rev, 2008,4:57-68.

[7]Konigshoff M,Kneidinger N,Eickelberg O.TGF-beta signaling in COPD:deciphering genetic and cellular susceptibilities for future therapeutic regimen[J].Swiss Med Wkly,2009,139:554-563.

[8]Groneberg D,Witt H,Adcock,et al.Smads as intracellular mediators of airway inflammation[J].Experimental Lung Research, 2004,30:223-250.

[9]Kim DY,Kwon EY,Hong GU,et al.Cigarette smoke exacerbates mouse allergic asthma through Smad proteins expressed in mast cells[J].Respir Res,2011,12:49.

[10]Zhao W,Gomez G,Yus H,et al.TGF-betal attenuates mediator release and de novo Kit expression by human skin mast cells through a Smad-dependent pathway[J].J Immunol,2008,181(10):7263-7272.

[11]Turner NJ,Jones HS,Davies JE,et a1.Cyclic stretch-induced TGF-betal/Smad signaling inhibits adipogenesis in umbilieal cord progenitor cells[J].Bioehem Biophys Res Commun,2008,377(4): 1147-1151.

Relationship between the expression of Smad protein and transforming growth factor beta-1 and the airway remodeling in lung parenchymal of patients with COPD.

GUAN Pin1,CHEN Juan1,FENG Guang-qiu1,WU Jie2.
1.Medical Care Center,Pepole's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Hainan Medical Univesity,Haikou 571199,Hainan,CHINA

>ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of TGF-β1and smads in lung parenchymal of patients with COPD.MethodsAccording to the pulmonary function,the patients were divided into two groups:24 patients without COPD and 24 patients with COPD.We observed the histopathological features and measured the thickness of the airway wall and the smooth muscle layer of the small airway by means of semi-quantitatively image analyzer.The expressions of Smad2,Smad3,Smad7 and TGF-β1were determined by western blot.Results(1)There were higher level of Smad2,Smad3 and TGF-β1in patients with COPD than without COPD(P＜0.05,respectively).The level of TGF-β1was positively correlated with those of Smad2 and Smad3 (P＜0.05,respectively),but negatively correlated with that of Smad7.(2)The level of Smad2,Smad3 and TGFβ1were positively correlated with WAt/Pi and WAsm/Pi,respectively,but Smad7 were negatively correlated with WAt/Pi and WAsm/Pi,respectively.ConclusionTGF-β1/Smads signal transduction pathway is the key of airway remodeling in COPD,and Smad2 and Smad3 play the regulatory role,while Smad7 plays the inhibitive role.

Chronic obstructive pulmonary disease(COPD);Airway remodeling;Transforming growth factor beta-1;Smad protein

R563

A

1003—6350（2014）12—1720—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.12.0670

2013-12-11)

海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：807081）

管頻。E-mail：gp0318@126.com