黃君華，張書(shū)婉，張寧

(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061)

PCR-DGGE結(jié)合測(cè)序在檢測(cè)混合細(xì)菌感染中的價(jià)值

黃君華1，張書(shū)婉2，張寧3

(1.西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系，陜西 西安 710021；2.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710003；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710061)

目的探討變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）結(jié)合測(cè)序在檢測(cè)混合細(xì)菌感染中的作用，為細(xì)菌多重感染的診斷提供新的思路。方法以3份臨床培養(yǎng)鑒定為混合感染的膽囊穿刺引流液為對(duì)象，提取細(xì)菌總DNA并擴(kuò)增16S rDNA-V3區(qū)，后進(jìn)行DGGE分析，將所得條帶切膠純化再擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及BLAST比對(duì)，比較比對(duì)結(jié)果與臨床培養(yǎng)結(jié)果的一致性。結(jié)果DGGE可以很好地分離16S rDNA-V3區(qū)混合PCR產(chǎn)物，每一個(gè)擴(kuò)增子的測(cè)序比對(duì)結(jié)果與臨床培養(yǎng)結(jié)果一致。結(jié)論P(yáng)CR-DGGE結(jié)合測(cè)序的方法可以很好地鑒定臨床混合感染標(biāo)本中的病原菌，可作為快速檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用。

混合細(xì)菌感染；通用引物PCR；變性梯度凝膠電泳；測(cè)序；快速檢測(cè)

混合細(xì)菌感染的發(fā)病率逐年增多[1]，而目前臨床上主要應(yīng)用培養(yǎng)的方法檢測(cè)混合細(xì)菌感染，耗時(shí)長(zhǎng)，檢出率低，容易出現(xiàn)假陰性[2]。近些年，分子生物學(xué)方法，尤其是16S rDNA PCR技術(shù)[3]，在快速檢測(cè)細(xì)菌感染方面應(yīng)用廣泛，然而檢測(cè)混合細(xì)菌感染的分子生物學(xué)方法較少。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用通用引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA-V3區(qū)，混合的擴(kuò)增子在變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，從而使長(zhǎng)度相同但序列不同的擴(kuò)增子相互分離，然后將擴(kuò)增子進(jìn)行回收測(cè)序和序列比對(duì)，并將比對(duì)結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果相比較，取得滿意的預(yù)期目標(biāo)，為檢測(cè)混合感染提供了新的分子生物學(xué)途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料從西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科收集3份經(jīng)VITEK compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀培養(yǎng)鑒定為混合細(xì)菌感染的膽囊穿刺引流液各2 ml。

1.2 方法

1.2.1 穿刺引流液細(xì)菌總DNA的提取將穿刺引流液標(biāo)本離心5 min，取沉淀，應(yīng)用QIAamp Blood DNA Mini Kit試劑盒(QIAGEN，Cat.No.51106)，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增選擇可擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA-V3區(qū)的通用引物擴(kuò)增細(xì)菌總DNA。引物序列參照Muyzer等[4]設(shè)計(jì)，其中上游引物5'端延伸添加GC夾(GCclamps序例：GCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGG GGG)，用以提高PCR產(chǎn)物在DGGE中分離效率[5]。V3-F-GC：GCclamps-CCTACGGGAGGCAG，V3-R：ATTACCGCGGCTGCTGG，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為193 bp。50μlPCR反應(yīng)體系，包括：10×buffer5μl，10mmol/LdNTP 1μl，2.5 mmol/LMgCl25μl，5μmol/LV3-F、V3-R各2μl，Taq酶(5 U/μl)0.4μl，DNA模板4μl，ddH2O 30.6μl。PCR反應(yīng)程序：采用touchdown PCR[4]，即預(yù)變性95℃5 min；95℃變性1 min，退火溫度初次設(shè)定為65℃1 min，延伸65℃1 min，退火溫度每2個(gè)循環(huán)降低1℃，最后退火溫度降到55℃，在此退火溫度上再進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；72℃7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳的電壓為6 V/cm，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，后在凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。

1.2.3 DGGE分析應(yīng)用DcodeTM Universal Mutation檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，Herchles，CA，USA)，膠板大小16 cm×10 cm×1 cm。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)反復(fù)摸索得到16S rDNA-V3區(qū)通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE電泳的最適條件為：聚丙烯凝膠膠濃度為8%，變性梯度范圍(由上到下)為30%～65%。按照儀器使用說(shuō)明將凝膠裝置在電泳系統(tǒng)中，在新配置的1×TAE電泳緩沖液中，以150 V電壓預(yù)電泳30 min，然后取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物，與6×loading buffer混勻，加入到上樣孔中，安裝好電泳系統(tǒng)后，即電泳：先以60 V電泳1 h，后以100 V電壓12 h，電泳溫度設(shè)置為60℃。電泳完畢后，小心地將膠放入EB溶液(終濃度為0.5 μg/ml)中染色20 min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存。用潔凈的刀片切下目的條帶，放入盛有100μl 1×TE的1.5 ml滅菌Ep管中。將盛有凝膠的Ep管放入99℃金屬浴20 min，使凝膠融化，然后以管中液體為模板，再次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序如前所述，但引物為不帶GC夾的V3-F/V3-R。

1.2.4 測(cè)序比對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，登陸http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，將測(cè)序結(jié)果在Gen-Bank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA-V3區(qū)通用引物擴(kuò)增結(jié)果16S rRNA-V3區(qū)通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小(193 bp)相符合(圖1)。從結(jié)果可以看出混合細(xì)菌經(jīng)通用引物擴(kuò)增后僅有一種大小的產(chǎn)物，且混合擴(kuò)增子經(jīng)普通瓊脂糖電泳無(wú)法區(qū)分。

2.2 DGGE結(jié)果我們預(yù)想16S rRNA-V3區(qū)通用引物所產(chǎn)生的混合擴(kuò)增子通過(guò)DGGE可分離開(kāi)，若出現(xiàn)兩條條帶，說(shuō)明混合PCR產(chǎn)物中有兩種擴(kuò)增子；若出現(xiàn)三條條帶，說(shuō)明有三種擴(kuò)增子；若條帶出現(xiàn)在同一水平上則應(yīng)為同一種病原菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)想的相同(圖2)，1道有兩條條帶，臨床培養(yǎng)出兩種菌(糞腸球菌、陰溝腸桿菌)；2道有三條條帶，臨床培養(yǎng)出三種菌(糞腸球菌、屎腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌)；3道有三條條帶，臨床培養(yǎng)出三種菌(屎腸球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌)。

圖1 16 S rRNA-V3區(qū)通用引物擴(kuò)增結(jié)果

圖2 多重感染標(biāo)本DGGE結(jié)果

2.3 DGGE圖譜切膠回收測(cè)序結(jié)果將所得到的8條條帶進(jìn)行測(cè)序，得到8個(gè)測(cè)序結(jié)果，利用BLAST進(jìn)行比對(duì)。從結(jié)果中可以看到，比對(duì)結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果一致，并證實(shí)圖譜上同一位置條帶為相同菌種(表1，圖2)。

表1 混合感染16S rRNA-V3區(qū)PCR-DGGE回收條帶測(cè)序結(jié)果及臨床培養(yǎng)結(jié)果

3 討論

DGGE是根據(jù)DNA的解鏈特性，在不同濃度的變性劑中，不同堿基組成的DNA雙螺旋的解鏈行為不同而導(dǎo)致其電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而序列不同的DNA片段很理想地分開(kāi)。DGGE主要應(yīng)用在生物多樣性調(diào)查、親緣關(guān)系鑒定、基因突變檢測(cè)等領(lǐng)域。在微生物研究領(lǐng)域中，其主要應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)。1993年Muyzer等[4]首次將變性梯度凝膠電泳技術(shù)應(yīng)用到微生態(tài)領(lǐng)域。該技術(shù)對(duì)微生態(tài)的分析主要包括三步：首先從微生態(tài)標(biāo)本中提取所有微生物總的DNA；其次用16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將混合的擴(kuò)增子在變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，從而使長(zhǎng)度相同但序列不同的擴(kuò)增子相互分離；最后進(jìn)行DGGE指紋圖譜分析。該技術(shù)的一大優(yōu)點(diǎn)是可以從凝膠中切下條帶,然后通過(guò)測(cè)序來(lái)鑒定菌種。不足之處在于如果不同DNA片段有相似的融點(diǎn)行為，則不能分離開(kāi)來(lái)。為達(dá)到良好的分離效果，通常在一條通用引物的5'端連接一段長(zhǎng)度為30～50bp富含GC的核苷酸序列，稱為GC夾(GC-clamps)，這樣可以顯著地提高分辨力。Wu等[5]應(yīng)用UP-PCR擴(kuò)增腸道菌群16S rRNA基因V3區(qū)，然后用DGGE進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2型糖尿患者與正常人的腸道菌群有顯著差異。

所有原核細(xì)胞基因組DNA經(jīng)16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增后，所產(chǎn)生的擴(kuò)增子長(zhǎng)度都是相同的，因此對(duì)于混合細(xì)菌感染，僅用通用引物PCR和測(cè)序無(wú)法對(duì)感染病原菌進(jìn)行鑒定。為了鑒定混合感染中的各個(gè)病原菌種類，本實(shí)驗(yàn)用DGGE對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析。首先從標(biāo)本中提取所有病原菌的DNA，然后用16S rRNA基因通用引物V3-F/V3-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到193 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將混合的擴(kuò)增子在變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳使之相互分離，最后從凝膠中切下條帶，通過(guò)測(cè)序來(lái)鑒定菌種，取得良好的效果，為多重感染標(biāo)本中病原菌的分離鑒定提供了新思路。為達(dá)到良好的分離效果，提高分辨力，本實(shí)驗(yàn)也用了GC夾。由培養(yǎng)結(jié)果、DGGE結(jié)果和測(cè)序比對(duì)結(jié)果可知，在DGGE圖譜中，同一水平位置上的條帶為一種菌(條帶1和3為糞腸球菌；條帶4和6為屎腸球菌)；兩種菌感染出現(xiàn)兩條條帶，三種菌感染會(huì)出現(xiàn)三條條帶。

混合細(xì)菌感染可發(fā)生于許多疾病，如支氣管肺炎[6]、肺結(jié)核[7]、腦膿腫、腦膜炎[8]、骨關(guān)節(jié)感染[9]、糖尿病、膽囊感染、胸腹水感染、感染性心內(nèi)膜炎[10]等。目前臨床主要通過(guò)培養(yǎng)進(jìn)行鑒定，耗時(shí)較長(zhǎng)，假陰性率高。一些分子生物學(xué)方法，如多重PCR、熒光定量PCR[11]，檢測(cè)范圍窄，同樣會(huì)出現(xiàn)假陰性。本方法不僅適用于膽囊穿刺引流液，同樣適用于其他無(wú)菌部位混合感染的病原菌鑒定，后期工作需增加樣本的來(lái)源種類和數(shù)量，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的靈敏度和特異性，規(guī)范操作步驟，使其具有臨床實(shí)用性。

綜上所述，PCR-DGGE結(jié)合基因測(cè)序是一種很有前景的檢測(cè)混合細(xì)菌感染的方法，能夠達(dá)到與常規(guī)培養(yǎng)一致的效果。

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Value of PCR-DGGE following by sequencing for detecting mixed bacterial infection.

HUANG Jun-hua1,

ZHANG Shu-wan2,ZHANG Ning3.
1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021, Shaanxi,CHINA;2.Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA;3.Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital,School of Medicine,Xi'an Jiaotong University,Xi'an710061,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo explore the value of PCR-DGGE and sequencing for detecting mixed bacterial infection.MethodsA total of 3 samples which has been identified mixed bacterial infection by culture were included.The bacterial DNA was extracted and amplified the 16S rDNA-V3，following by DGGE,sequencing and BLAST.Then,to compare the consistency of BLAST and cultivation.ResultsDGGE could differentiate the mixed amplicons of 16SrDNA-V3 sensationally,and the results of BLAST and cultivation were consistent.ConclusionPCR-DGGE and sequencing provide a new way to diagnose mixed bacterial infection,which might be effective for identifying the pathogen in the sample.

Mixed bacterial infection;Broad-spectrum PCR;DGGE;Sequencing;Rapid detection

R37

A

1003—6350（2014）08—1154—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.08.0447

2013-11-10)

黃君華。E-mail：huangjunhua1985@163.com